王亞麗 齊 娜 梁建議 仝武寧 陜西中醫(yī)學(xué)院（咸陽(yáng)712046）

帕金森?。≒arkinson’s disease，PD），是最常見的神經(jīng)系統(tǒng)慢性退行性疾病之一。中樞神經(jīng)系統(tǒng)（central nervous system，CNS）緩慢進(jìn)展的炎癥反應(yīng)可能在PD 的病理進(jìn)程中扮演著重要角色，小膠質(zhì)細(xì)胞作為中樞神經(jīng)系統(tǒng)重要的免疫細(xì)胞，在這一病理過程中處于核心地位。小膠質(zhì)細(xì)胞對(duì)CNS內(nèi)穩(wěn)態(tài)的失衡極為敏感而極易被激活。激活后，其特異性膜表面分子的表達(dá)明顯上調(diào)，細(xì)胞數(shù)目大量增殖，且形態(tài)發(fā)生了顯著變化，如胞體增大，細(xì)胞突起變短、變粗或消失，呈桿狀、類圓形或典型的阿米巴狀。激活后的小膠質(zhì)細(xì)胞所產(chǎn)生的大量炎癥介質(zhì)，如一氧化氮（NO）、白細(xì)胞介素lβ（IL－1β）、腫瘤壞死因子α（TNF－α）、干擾素γ（IFN）及前列腺素E－2（PGE－2）等被認(rèn)為對(duì)神經(jīng)元損傷具有重要作用。多數(shù)研究表明激活的小膠質(zhì)細(xì)胞可通過產(chǎn)生各種炎癥介質(zhì)來?yè)p傷神經(jīng)元細(xì)胞。本研究擬開展中藥復(fù)方疏筋解毒方對(duì)脂多糖誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞激活形態(tài)改變的干預(yù)作用，探討小膠質(zhì)細(xì)胞的激活與帕金森病之間的內(nèi)在關(guān)聯(lián)性。

1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 選擇清潔級(jí)健康成年SD 大鼠30只，雌雄各半，體重220±20g，合格證編號(hào)：SCXK（陜）2007－001；大鼠及標(biāo)準(zhǔn)飼料均由西安交通大學(xué)醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，飼養(yǎng)條件：5只／籠，自由飲水、進(jìn)食，動(dòng)物房12h光、暗交替，平均溫度23±1℃。將30只雌雄各半SD 大鼠分別稱重、編號(hào)后，運(yùn)用隨機(jī)數(shù)表法分為對(duì)照組和中藥組，每組15只，以制備含藥血清。

選擇出生24～48h的SD 乳鼠，每次實(shí)驗(yàn)10只，合格證編號(hào)：SCXK（陜）2007－001；提供單位同上，用于MG 的原代離體培養(yǎng)。

2 實(shí)驗(yàn)用藥 疏筋解毒方主要由龜版、雞血藤、熟地、白芍、土茯苓等十余味中藥組成，購(gòu)買諸藥經(jīng)生藥學(xué)鑒定，符合2010版藥典規(guī)定的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。將上述藥物按處方組成比例，洗凈泥沙，加水浸泡1h，按照龜版先下，阿膠烊化等煎藥規(guī)則，砂鍋常規(guī)煎煮兩次，將兩次所煎藥液混合濃縮成含生藥1.9g／mL的水煎液，分裝、密封，4℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

圖1 各組小膠質(zhì)細(xì)胞不同時(shí)段的形態(tài)變化

3 含藥血清及正常鼠血清制備 將30只SD 大鼠隨機(jī)分組，適應(yīng)飼養(yǎng)3d后，中藥組給予疏筋解毒方中藥水煎劑灌胃，2次／d，按照人與大鼠體表面積劑量換算標(biāo)準(zhǔn)［1］確定灌胃劑量（12.6g·kg－1·d－1），連續(xù)3d；對(duì)照組給予等體積的生理鹽水灌胃。末次給藥后禁食禁水1h，經(jīng)右心室取血，靜置2h，離心（4℃2000r／min 20min），分離血清，56℃滅活30min，0.22μm 濾器過濾除菌、分裝，－20℃冰箱保存?zhèn)溆谩?/p>

4 實(shí)驗(yàn)材料

4.1 實(shí)驗(yàn)細(xì)胞：采用溫和消化法獲得純化的原代小膠質(zhì)細(xì)胞，細(xì)胞純度＞95%。將MG 分為：正常組、對(duì)照組及大、中、小劑量中藥組5組。

4.2 實(shí)驗(yàn)試劑：低糖型DMEM 培養(yǎng)液，胎牛血清，正常鼠血清，含藥血清，雙抗，1μg／mLLPS溶液，0.002%多聚賴氨酸PDL，0.1M PBS緩沖液，0.01M PBS，丙酮，一抗（CD11b／c克隆號(hào)：OX－42），SP免疫組化檢測(cè)試劑盒，DAB顯色試劑盒，蘇木素，中性樹脂。

4.3 實(shí)驗(yàn)儀器：超凈工作臺(tái)，CO2培養(yǎng)箱，倒置顯微鏡，熒光顯微鏡，高速冷凍離心機(jī)，細(xì)胞計(jì)數(shù)板，離心管，彎頭吸管，24孔細(xì)胞培養(yǎng)板等。

5 實(shí)驗(yàn)方法及步驟

5.1 細(xì)胞爬片：收集純化的MG，細(xì)胞計(jì)數(shù)，濃度為1×105／mL接種于24孔培養(yǎng)板中（預(yù)先置有0.002%PDL 處理過的1／4蓋玻片），500μL／孔，分為正常組、對(duì)照組及大、中、小劑量中藥組，共5組；其中正常組設(shè)4孔，余每組各設(shè)3孔，CO2培養(yǎng)箱中適應(yīng)性培養(yǎng)24h之后，每孔吸除50μL 的細(xì)胞上清，對(duì)應(yīng)補(bǔ)加正常鼠血清及大中小劑量的混合血清50μL／孔，則各組細(xì)胞中的培養(yǎng)液可視為血清終濃度為10%的完全培養(yǎng)液，其中正常組與對(duì)照組為10%正常鼠血清的完全培養(yǎng)液，大、中、小劑量中藥組則分別為含藥血清濃度為10%、5%、0.5%的完全培養(yǎng)液。

5.2 在加入正常鼠血清及含藥血清混合液30min后，加入終濃度為1μg／mL 的LPS，分別于加入血清作用12h、24h、36h、48h之后，取出細(xì)胞爬片，將培養(yǎng)好的細(xì)胞爬片于濕盒中進(jìn)行免疫組化染色。后中性樹脂封片，觀察、攝像。

6 結(jié)果 疏筋解毒方對(duì)于不同時(shí)段MG 形態(tài)變化的影響，見圖1。由表中的圖片可看出：正常組的小膠質(zhì)細(xì)胞形態(tài)較穩(wěn)定，其胞體呈扁橢圓形或三角形，大多細(xì)胞只有一個(gè)纖細(xì)突起，而再無其它分支（較在體的MG 不同），形似蝌蚪。小膠質(zhì)細(xì)胞特異性免疫組化著色在48h明顯變淺，表明其細(xì)胞膜分子CR3（可與OX－42特異性結(jié)合）表達(dá)下調(diào)，細(xì)胞活性欠佳。與正常組相比，對(duì)照組中MG 數(shù)量有所增加，在12h其胞體明顯變大呈橢圓形，部分細(xì)胞突起明顯短粗，呈現(xiàn)典型的阿米巴狀，部分細(xì)胞無突起，免疫組化著色明顯加深；24h之后，MG 胞體更加腫脹，48h大多細(xì)胞幾乎裂解死亡，由此可見終濃度為1μg.mL－1的LPS可誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞出現(xiàn)明顯的形態(tài)學(xué)變化。與對(duì)照組比較，小、中劑量組的MG 著色相對(duì)較淺，胞體相對(duì)較小，細(xì)胞腫脹、裂解的程度有所減輕，且時(shí)間相對(duì)推后；大劑量組相對(duì)于對(duì)照組而言，不僅胞體小多呈桿狀，且細(xì)胞突起的存在較為明顯，僅少數(shù)細(xì)胞出現(xiàn)腫脹、裂解情況，大多細(xì)胞仍保持完整的形態(tài)，部分細(xì)胞似乎有向靜息狀態(tài)轉(zhuǎn)變的可能。

7 討 論 小膠質(zhì)細(xì)胞在生理情況下，處于靜息狀態(tài)。其在CNS中介導(dǎo)炎癥反應(yīng)的免疫細(xì)胞類型中居于核心地位，對(duì)周圍微環(huán)境的變化極其敏感，極易被激活。況且，中腦黑質(zhì)區(qū)發(fā)生氧化應(yīng)激的幾率較其他區(qū)域顯著；而MG 在此處分布密集、其被激活后便成為大量超氧化物等自由基產(chǎn)生的主要來源；加之，DA 能神經(jīng)元較其他類型的神經(jīng)元更易受到自由基的損傷［2］。由此可見，MG 的激活與PD 的發(fā)病密切相關(guān)，且其激活的程度與多巴胺能神經(jīng)元的損傷程度及帕金森病的病程進(jìn)展之間存在一定的聯(lián)系［3］。

LPS是一種強(qiáng)效炎癥反應(yīng)誘導(dǎo)劑，可與MG 上的脂多糖結(jié)合蛋白結(jié)合，能夠激活MG 表達(dá)和釋放多種細(xì)胞因子和細(xì)胞毒性物質(zhì)，發(fā)揮其毒性作用［4］。諸多研究表明，LPS模擬的是炎癥損傷機(jī)制造成的慢性進(jìn)行性神經(jīng)變性過程，符合PD 的漸進(jìn)性變性進(jìn)程。激活的MG 會(huì)導(dǎo)致其膜表面分子Ⅲ型補(bǔ)體受體的增加，并能與OX－42特異性結(jié)合，此二者的結(jié)合作為對(duì)MG的特異性標(biāo)記已為研究領(lǐng)域廣泛認(rèn)可。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，脂多糖可有效刺激原代培養(yǎng)的小膠質(zhì)細(xì)胞增殖、活化，同時(shí)也能使其形態(tài)學(xué)發(fā)生改變，并促進(jìn)其快速凋亡。在自身免疫或過度炎癥反應(yīng)等病理情況下，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化與增殖，促進(jìn)其向靜息狀態(tài)轉(zhuǎn)變或快速死亡對(duì)于保護(hù)神經(jīng)細(xì)胞免受氧化應(yīng)激等損傷是非常有益的。分析本實(shí)驗(yàn)對(duì)照組經(jīng)LPS刺激，MG 在大量顯著活化的同時(shí)也伴隨其自身的快速裂解死亡，這可能與LPS工作濃度較大、毒性作用較強(qiáng)有關(guān)，也不排除MG 激活后分泌產(chǎn)生大量的炎癥介質(zhì)不僅會(huì)對(duì)神經(jīng)元細(xì)胞造成損傷，同時(shí)對(duì)其自身亦造成嚴(yán)重的損害。疏筋解毒方各含藥血清組對(duì)LPS誘導(dǎo)MG 的激活有不同程度的抑制作用，尤其是大劑量組的有效性較為明顯：本組激活的MG 形態(tài)介于過度激活狀態(tài)與靜息狀態(tài)之間，到實(shí)驗(yàn)后期其細(xì)胞碎裂程度較各組尤其是對(duì)照組有所改善，部分細(xì)胞形態(tài)趨于靜息形態(tài)。由此推斷疏筋解毒方抑制MG 的活化可能與其能減緩激活MG 自身快速死亡而促進(jìn)其向靜息形態(tài)轉(zhuǎn)變的作用相關(guān)。

8 結(jié) 論 本課題組以中醫(yī)理論為基礎(chǔ)，結(jié)合帕金森病的病證特點(diǎn)及現(xiàn)代中醫(yī)藥對(duì)本病治療的研究進(jìn)展以及多年的臨床經(jīng)驗(yàn)，從補(bǔ)益肝腎及活血解毒兩個(gè)角度立法處方，總結(jié)研制出中藥復(fù)方—疏筋解毒方。該方主要由雞血藤、龜版、熟地黃、白芍、阿膠、全蝎及生甘草等十余味中藥組成。主要功效：疏筋通絡(luò)解毒，滋陰養(yǎng)血熄風(fēng)。

本研究表明疏筋解毒方對(duì)激活MG 的形態(tài)具有一定的影響作用，可能有減緩激活小膠質(zhì)細(xì)胞自身快速死亡而促進(jìn)其向靜息形態(tài)轉(zhuǎn)變的作用。從形態(tài)學(xué)上表明該方可通過阻抑MG的激活以達(dá)到神經(jīng)保護(hù)的作用。這為進(jìn)一步研究疏筋解毒方治療帕金森病提供了較有價(jià)值的思路和依據(jù)。

［1］ 徐淑云.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)［M］.北京：人民衛(wèi)生出版社，2001：37.

［2］ Greenamyre JT，MacKenzie GM，Peng TI，et al.Mitochondrial dysfunction in Parkinson’s disease［J］.Bioehem Soc Symp.1999，66：85－97.

［3］ Ouchi Y，Yagi S，Yokokura M，et al.Neuroinflammation in the living brian of Parkinson’s disease［J］.Parkinsonism Relat Disord，2009，15：200－204.

［4］ Jeohn GH，Cooper CL，Wilson B，et al p38 MAP kinase is involved in lipopolysaccharide－induced dopaminerg ic neuronal cell death in rat mesencephalic neurorr glia cultures［J］.Ann N Y Acad Sci，2002，962：332－346.