馬居里 耿翠翠 朱?;?嚴(yán)惠芳 白 潔 應(yīng)小平 冷 偉 張 賓 李 媛 楊 智
陜西中醫(yī)學(xué)院(咸陽(yáng)712045)
慢性腎衰竭(chronic renal failure,CRF)簡(jiǎn)稱慢性腎衰,是各種慢性腎臟疾病,引起腎功能和腎單位緩慢進(jìn)行性不可逆的喪失,導(dǎo)致以代謝產(chǎn)物和毒性產(chǎn)物潴留、水電解質(zhì)和酸堿平衡紊亂以及內(nèi)分泌失調(diào)為特征的臨床綜合征。扶正泄?jié)岜DI湯為陜西省名中醫(yī)馬居里教授的臨床經(jīng)驗(yàn)方,該方對(duì)早、中期慢性腎功能衰竭有較好的療效,既往有實(shí)驗(yàn)研究表明該方具有降低腎衰大鼠Cr、BUN、血清瘦素作用。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)觀察該方對(duì)慢性腎衰大鼠腎組織中Smad4、Smad7信號(hào)蛋白治療前后表達(dá)的影響,探討其抗腎間質(zhì)纖維化、延緩CRF進(jìn)展的機(jī)制。
1.1 實(shí)驗(yàn)用藥及試劑 腺嘌呤(Adenine,C5H5N5),批號(hào)082013,上海麗珠東風(fēng)生物技術(shù)有限公司生產(chǎn);氯沙坦鉀(科素亞),批號(hào)110020,杭州默沙東制藥有限公司生產(chǎn);扶正泄?jié)岜DI湯(蟲草菌粉、黃芪、生曬參、蒼術(shù)、熟地黃、當(dāng)歸、山藥、半夏、橘紅、茯苓、枳實(shí)、大黃、水蛭、車前子等),藥材購(gòu)于陜中附院中藥房,由陜西中醫(yī)學(xué)院藥理實(shí)驗(yàn)室制成濃縮液。Smad4試劑盒:批號(hào)BA1397,購(gòu)于武漢博士德生物工程有限公司;Smad7試劑盒:批號(hào)990779W,購(gòu)于北京博奧森生物有限公司;山羊抗兔(II抗):批號(hào)CW0103,購(gòu)于北京康為世紀(jì)生物科技有限公司。
1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型及分組 健康SD 雄性大鼠50只,5周齡,體重200±10g,由西安市灃渭新區(qū)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供,合格證號(hào):SCXK(陜)2007-001,適應(yīng)1周后,隨機(jī)分成2組:空白組(10只)、造模組(40只)。按200mg/kg·d 劑量將腺嘌呤制成混懸液1mL,每日晨8時(shí)給造模組大鼠灌胃喂藥[1]。造模全程24d,前12d,每日給藥1次;第13 天開始,隔日給藥1次??瞻捉M不干預(yù)。造模后,將40只大鼠隨機(jī)分為模型組、科素亞組(5mg/kg)、扶正泄?jié)岜DI湯高、低劑量組(37.6g/kg、18.8g/kg),每組10 只。
1.3 給藥方法及喂養(yǎng) 實(shí)驗(yàn)第25天開始,根據(jù)文獻(xiàn)[6]大鼠用量按人與動(dòng)物體表面積的等效比值表折算給藥量。各治療組每日晨8時(shí)給予相應(yīng)藥物灌胃(10mL/kg),空白組和模型組各予生理鹽水,共治療30d。整個(gè)實(shí)驗(yàn)過(guò)程中大鼠均自由攝食和飲用自來(lái)水,室溫控制在19~22℃,相對(duì)濕度維持在60%~70% 。
1.4 標(biāo)本采集 于實(shí)驗(yàn)第54d晨8時(shí)至次日晨8時(shí),收集各組大鼠24h尿液,備測(cè)24h尿蛋白定量;后用10%水合氯醛腹腔注射麻醉,剪開胸腹腔,心臟取血5mL,備測(cè)BUN、Cr;處死大鼠,摘取腎臟,置10%的福爾馬林溶液中固定,送病檢。
1.5 圖像分析 采用分析測(cè)量圖象軟件Imagepro-Plus分別對(duì)各組免疫組化染色的腎臟標(biāo)本切片進(jìn)行測(cè)量。通過(guò)光學(xué)顯微鏡攝取圖像,輸入圖像分析軟件內(nèi),進(jìn)行灰度變換,使陽(yáng)性面積與背景分開,進(jìn)行自動(dòng)測(cè)量。對(duì)每組切片隨機(jī)選取15個(gè)不重疊視野,計(jì)算陽(yáng)性面積和整個(gè)視野面積的比值(去除腎血管腔所占面積),取其平均值進(jìn)行比較。
2.1 一般情況觀察 空白組大鼠攝食量隨體重漸增,反應(yīng)靈敏、好動(dòng),體毛光滑、有光澤,耳廓、眼瞼結(jié)膜紅潤(rùn),舌質(zhì)紅,舌下靜脈無(wú)曲張,尾巴皮溫可,外陰周圍干燥,二便正常。模型組至灌服腺嘌呤起,大鼠逐漸出現(xiàn)體重增加較慢或減輕,攝食減少,精神萎靡,弓背蜷縮、腹部膨隆、喜臥懶動(dòng),體毛明顯脫落、干枯少澤,耳廓、眼瞼結(jié)膜蒼白,舌質(zhì)暗、有明顯瘀血象,尾巴皮膚發(fā)涼,外陰周圍有濕毛,大便溏、小便先增多后減少。隨著治療時(shí)間的延長(zhǎng),各治療組大鼠癥狀均有不同程度的改善。中藥高劑量組癥狀改善最為明顯;中藥低劑量組和科素亞組癥狀改善程度相當(dāng)。實(shí)驗(yàn)全程死亡2只大鼠,造模過(guò)程中無(wú)大鼠死亡,在治療過(guò)程中模型組死亡1只,中藥低劑量組意外(灌入氣管)死亡1只。其余各組如數(shù)存活。
2.2 各組大鼠Scr、BUN 及24h尿蛋白定量檢測(cè)結(jié)果 見表1。
表1 各組大鼠Scr、BUN、24h尿蛋白定量結(jié)果(±s)
表1 各組大鼠Scr、BUN、24h尿蛋白定量結(jié)果(±s)
注:與空白組比較△P<0.01;與模型組比較▲P<0.01;與中藥高劑量組比較◇P<0.05;與中藥低劑量組比較◆P>0.05。
組 別n(只)Scr(umol/L)BUN(mmol/L)尿蛋白定量(g/24h)10 56.7±10.22 7.92±1.42 4.53±0.67模型組9 165.33±12.24△18.12±1.98△8.39±0.99△中藥高劑量組10 83.80±10.58▲9.79±1.21▲5.37±1.09▲中藥低劑量組9 98.89±15.97▲◇11.48±1.39▲◇6.07±1.04▲◇科素亞組10 101.7±9.67▲◇◆11.81±1.25▲◇◆6.23±0.74空白組▲◇◆
2.3 腎組織Smad4、Smad7 蛋白的表達(dá) 見表2。免疫組化陽(yáng)性表現(xiàn)呈黃褐色顆粒狀;Smad4蛋白主要在大鼠腎小球細(xì)胞胞漿內(nèi)和腎小管上皮細(xì)胞內(nèi)表達(dá);Samd7蛋白主要在腎小球細(xì)胞胞漿內(nèi)表達(dá),腎小管可見少量表達(dá);空白組Smad4呈弱陽(yáng)性表達(dá);Samd7呈強(qiáng)陽(yáng)性表達(dá)。模型組Smad4表達(dá)較空白組均明顯增強(qiáng);而Smad7表達(dá)較空白組明顯減弱。中藥高、低劑量組、科素亞組Smad4表達(dá)較模型組明顯減弱,其中以中藥高劑量組表達(dá)減弱最明顯,中藥低劑量組和科素亞組表達(dá)程度相當(dāng)。而中藥高、低劑量組、科素亞組Smad7表達(dá)較模型組明顯增強(qiáng);其中以中藥高劑量組表達(dá)增強(qiáng)為著,中藥低劑量組、科素亞組表達(dá)程度相當(dāng)。
2.4 病理(HE染色) 空白組大鼠腎小球、腎小管、間質(zhì)均正常。模型組大鼠腎小球數(shù)量減少,部分腎小球萎縮;近曲小管上皮細(xì)胞可見灶狀、片狀壞死,內(nèi)有淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),腎小管內(nèi)可見顆粒管型,部分腎小管囊狀擴(kuò)張;間質(zhì)纖維結(jié)締組織增生較明顯,血管未見異常??扑貋喗M大鼠腎小球數(shù)量輕度減少,少量腎小球萎縮;近曲小管上皮細(xì)胞可見灶狀壞死,內(nèi)有淋巴細(xì)胞浸潤(rùn),腎小管管腔內(nèi)見少量脫落的上皮細(xì)胞及管型,偶見腎小管囊狀擴(kuò)張;間質(zhì)纖維結(jié)締組織輕度增生,血管未見異常。中藥低劑量組病變與科素亞組差異不大。中藥高劑量組大鼠腎小球數(shù)量無(wú)明顯減少,偶見腎小球萎縮;腎小管無(wú)明顯病變,管腔內(nèi)偶見管型;間質(zhì)纖維結(jié)締組織增生不明顯,血管未見異常。
表2 各組大鼠Smad4、Smad7半定量結(jié)果(±s,%)
表2 各組大鼠Smad4、Smad7半定量結(jié)果(±s,%)
注:與空白組比較△P<0.01;與模型組比較▲P<0.01;與中藥高劑量組比較◇P<0.05;與中藥低劑量組比較◆P>0.05。
組 別n(只)Smad4Smad7空白組10 1.34±0.17 4.70±0.69模型組9 4.31±1.0△1.84±0.59△中藥高劑量組 10 2.46±0.51▲ 3.44±0.90▲中藥低劑量組9 3.62±0.87▲◇ 3.08±0.73▲◇科素亞組10 3.62±0.96▲◇◆2.80±0.93▲◇◆
Smads蛋白家族是近年來(lái)發(fā)現(xiàn)的新的細(xì)胞內(nèi)信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)蛋白,按其結(jié)構(gòu)和功能分為3個(gè)不同的亞族:一是受體激活Smad(R-Smad),包括Smad1、2、3、5 和Smad8;二是共同通路Smad(Co-Smad),目前研究只發(fā)現(xiàn)Smad4;三是抑制性Smad(ISmad),包括Smad6和Smad7。研究發(fā)現(xiàn)Sand2、3、4、7均參與TGF-β/Samd信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)。醫(yī)學(xué)公認(rèn)TGF-β是最主要的致纖維化因子,它參與腎間質(zhì)纖維化的各個(gè)環(huán)節(jié),是導(dǎo)致腎功能衰竭的主要病理機(jī)制[3],但由于TGF-β的多效性,抗TGF-β治療可能引起其它潛在的生物效應(yīng),采取針對(duì)TGF-β下游因子(如結(jié)締組織生長(zhǎng)因子(CTGF)、Smad4、Smad7和細(xì)胞外基質(zhì)黏附蛋白(βig-h(huán)3))生物學(xué)效應(yīng)的藥物可能是相對(duì)安全并有效減輕和延緩間質(zhì)纖維化的新途徑[4]。許多中藥或者中藥復(fù)方制劑對(duì)腎間質(zhì)纖維化影響的研究已經(jīng)達(dá)到分子水平,大量的臨床及動(dòng)物實(shí)驗(yàn)已經(jīng)證明,一些中藥通過(guò)干預(yù)TGF-β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路起到抗纖維化作用[5]。
慢性腎衰的中醫(yī)病機(jī)多為脾腎衰敗、氣血陰陽(yáng)虧損,濕、濁、瘀、毒諸邪蘊(yùn)結(jié)三焦所致。臨床表現(xiàn)往往虛實(shí)互見、錯(cuò)綜復(fù)雜、變化多端,辨證治療上亦感棘手。馬居里教授依據(jù)“扶正固本,祛邪治標(biāo)”、“扶正不戀邪,祛邪不傷正”的治療原則,顧及該病的病理特點(diǎn),建立了以補(bǔ)脾益腎,祛濕化濁,解毒活血通絡(luò)的扶正泄?jié)岜DI湯。該方中以蟲草菌粉、生曬參、黃芪、山藥、白術(shù)、茯苓補(bǔ)脾益腎,平調(diào)陰陽(yáng);橘紅、半夏、車前子、枳實(shí)、大黃理氣降逆和胃,祛濕化濁以解毒;熟地黃、當(dāng)歸、水蛭補(bǔ)血活血通絡(luò)。從現(xiàn)代藥理學(xué)研究分析,該方中黃芪、當(dāng)歸、蟲草[3]、大黃、水蛭均據(jù)用抗纖維化的作用。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明扶正泄?jié)岜DI湯能改善腎衰大鼠的一般情況;降低血清BUN、Cr、24h尿蛋白定量,改善腎功能;抑制Smad4蛋白陽(yáng)性表達(dá),促進(jìn)Smad7蛋白陽(yáng)性表達(dá),進(jìn)而抑制腎組織纖維化進(jìn)展。實(shí)驗(yàn)結(jié)果還表明扶正泄?jié)岜DI湯高劑量對(duì)大鼠腎組織Smad蛋白的表達(dá)影響較低劑量組和科素亞組明顯,病理改變也比低劑量組輕,有一定劑量相關(guān),但本實(shí)驗(yàn)扶正泄?jié)岜DI湯僅設(shè)兩個(gè)劑量組,尚不能完全說(shuō)明高劑量為治療慢性腎衰竭的有效劑量,關(guān)于扶正泄?jié)岜DI湯的有效劑量范圍和量效關(guān)系有待于進(jìn)一步實(shí)驗(yàn);扶正泄?jié)岜DI湯方中單藥物是否對(duì)Smad蛋白有一定的調(diào)節(jié)作用也有待于我們研究。
[1] 傅曉晴,林若勤,武一曼,等.腺嘌呤制作腎陽(yáng)虛型慢性腎功能衰竭大鼠模型的生化研究[J].福建中醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào),2003,2(13):22-24.
[2] 施新猷.現(xiàn)代醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)[M].北京:人民軍醫(yī)出版社,2000,145-146.
[3] 龔 偉,鄭敬民.轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β[J].腎臟病與透析腎移植雜志,2004,13(6):554-556.
[4] Wang W,Koka V,Lan HY.Transforming growth factor-bata and smad signalingin kidney diseases.Nephrology(carlton),2005,10(1):48-56.
[5] 劉 鋰,張佩青.TGF-β/Smad信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)通路在腎纖維化中的作用機(jī)制及中藥的干預(yù)作用[J].中醫(yī)藥信息,2007,24(2):45-47.