趙宇鵬, 周 偉, 趙佩佩, 才金玲, 朱大玲, 潘光華, 劉洪艷, 王廣策

(1. 天津科技大學(xué) 海洋科學(xué)與工程學(xué)院, 天津 300457; 2. 中國科學(xué)院 海洋研究所, 山東 青島 266071; 3. 中國科學(xué)院大學(xué), 北京 100049)

紫菜(Porphyra)是一類原始紅藻, 屬于紅藻門(Rhodophyta)原紅藻綱(Rhodophyceae)紅毛菜亞綱(Bangiophycidae)紅毛菜目(Bangiales)紅毛菜科(Bangiaceae)紫菜屬(Porphyra)[1]。目前中國的栽培物種包括長江以南的壇紫菜(Porphyra haitanensis)和長江以北的條斑紫菜(Porphyra yezoensis), 其中條斑紫菜的產(chǎn)值最高。條斑紫菜是一種高蛋白、低脂肪的營養(yǎng)豐富的海藻, 富含人體所需的維生素和微量元素, 既可食用、藥用又可作為加工業(yè)的重要原料, 還可以用于水環(huán)境監(jiān)測和治理, 因此對于紫菜的研究具有非常高的應(yīng)用價值, 對于條斑紫菜蛋白組成的了解有助于分析其營養(yǎng)成分等方面的品質(zhì), 對生產(chǎn)應(yīng)用具有指導(dǎo)作用[2]。

蛋白質(zhì)組學(xué)是以細胞內(nèi)存在的全部蛋白質(zhì)及其活動規(guī)律為研究對象, 它是繼基因組學(xué)之后在分子水平上了解生命過程邏輯性的第二步, 是后基因組時代生命科學(xué)研究和核心內(nèi)容之一。早在蛋白質(zhì)組概念提出來之前的1975年, 二維凝膠電泳技術(shù)經(jīng)過長期發(fā)展, 和質(zhì)譜技術(shù)、生物信息學(xué)成為蛋白質(zhì)組學(xué)研究的三大核心技術(shù)[3]。雙向電泳是研究蛋白質(zhì)表達最有效的工具, 是一種同時對上千種蛋白質(zhì)進行分離的高分辨率的方法[4]。近年來雙向電泳技術(shù)在植物應(yīng)用中有不少報道, 但大部分集中在一些高等模式生物上, 對于條斑紫菜的應(yīng)用還沒見報道, 條斑紫菜富含色素、多酚、多糖等次生代謝產(chǎn)物, 其蛋白樣品制備相對于其他植物更加困難。作者比較了硫酸銨沉淀法、丙酮—TCA法和酚提取方法等幾種方法, 對條斑紫菜葉狀體總蛋白的提取效果, 發(fā)現(xiàn)酚提取法能更好地提取蛋白,更高效地除去樣品的鹽離子及其他干擾雜質(zhì), 適用于組織復(fù)雜的植物[5-7], 并在此方法基礎(chǔ)上進行了改進。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

條斑紫菜葉狀體采自江蘇南通栽培海區(qū), 取回實驗室后用消毒海水洗凈, 陰干, 凍存于-80℃待用。

1.2 試劑與儀器

二維電泳系統(tǒng)、掃描儀、固化IPG干膠條pH 3～10線性17 cm、IPG(Immobilized pH gradients)緩沖液、IPG覆蓋油、兩性電解質(zhì)購自美國Bio-Rad公司; 過硫酸銨、硫脲、CHAPS、PMSF、考馬斯亮藍 G-250、溴酚藍等購自Amersha Pharmacia公司。尿素、甘氨酸、丙烯酰胺、甲叉雙丙烯酰胺、Tris、碘乙酰胺、DTT、SDS、PVP、TEMED、β-巰基乙醇均購自美國 Sigma 公司。蛋白酶抑制劑、瓊脂糖、蛋白 Marker、低分子量標(biāo)準(zhǔn)蛋白質(zhì)、牛血清蛋白(BSA)購自北京鼎國生物技術(shù)公司。三氯乙酸、平衡飽和酚丙酮、乙醇等其他所用藥品或試劑為國產(chǎn)分析純級。

1.3 蛋白質(zhì)提取方法

-80℃凍存葉狀體材料稱質(zhì)量, 放入預(yù)冷的研缽中, 加入少量石英砂(二氧化硅), 加入10% PVPP[8], 研磨成粉末, 一直加入液氮保證組織不解凍(不溶的PVPP可以有效吸附酚類化合物)。

1.3.1 飽和硫酸銨沉淀法

(1) 研磨好的材料粉末加入2倍體積預(yù)冷的蛋白提取液(8 mol/L 尿素, 0.1 mol/L Tris, 1 mmol/L EDTA, 50 mmol/L 抗壞血酸, 1% β-巰基乙醇, 0.5 mmol/L PMSF, pH7.8), 混勻后于4℃放置過夜。

(2) 離心10 000 r/min, 20 min, 4℃, 去沉淀, 緩慢加入硫酸銨(冰浴)至飽和, 再次4℃過夜; 離心10 000 r/min, 20 min, 4℃, 取沉淀。

(3) 沉淀用裂解液(8 mol/L尿素, 4% CHAPS, 60 mmol/L DTT, 40 mmol/L Tris-HCl, pH8.8)重懸后離心10 000 r/min, 20 min, 4℃, 去除不溶物。上清用超濾管反復(fù)除鹽, 得到濃縮的蛋白。

1.3.2 三氯乙酸/丙酮沉淀法[9]

(1) 研磨好的材料粉末加入蛋白提取液(10%的三氯乙酸, 即10 g三氯乙酸溶解在100 mL丙酮中, 加70 μL?-巰基乙醇或DTT),-20℃過夜, 期間搖2～3次, 蛋白質(zhì)會形成白色沉淀。

(2) 10 000g, 4℃離心30 min, 用槍頭小心吸取上清丟棄, 加0.07%?-巰基乙醇于丙酮溶液中, 懸浮沉淀, 放-20℃約1 h, 期間搖1～2次。

(3) 重復(fù)步驟2 2～3次, 取沉淀-20℃ 低溫晾干, 約4～5 h, 打開離心管蓋子。

(4) 取出蛋白干粉, 加0.1 mol/L NaOH[10]溶液, 1 min, 加入蛋白裂解液, 4℃上下輕輕搖勻, 30 min～1 h左右 15℃離心, 10 000 g, 約20 min。取上清超濾除鹽。

1.3.3 酚提取方法[11-13]

酚提取緩沖液: 0.7 mol/L 蔗糖 0.1 mol/L KCL; 0.5 mol/L Tris-HCl pH7.5; 50 mmol/L EDTA。儲存在4℃約1個月。β-巰基乙醇終濃度2%(體積分數(shù)), PMSF終體積分數(shù)為1 mmol/L(儲存液用異丙醇配成100 mmol/L), 使用前添加。也可以使用全效蛋白酶抑制劑。

(1) 取研磨好粉末加入酚提取緩沖液, 晃勻放置10 min, 4℃, 間或搖晃幾次。

(2) 加入等體積pH7.5 Tris 飽和酚。

(3) 4℃震蕩混合物30 min, 然后5 000～10 000g, 4℃離心30 min, 酚溶解的蛋白質(zhì), 色素, 脂類在酚相中; PVPP, 不溶的細胞碎片, 糖類, 核酸, 鹽都存在于水相或形成沉淀。

(4) 收集上層酚相, 丟棄水相和沉淀(不要擾動界面上物質(zhì), 寧可浪費一些蛋白也不多吸污染物)。

(5) 加入與酚相體積相同的提取緩沖液, 重復(fù)3、4步驟兩次。

(6) 在收集酚相里加入5倍體積預(yù)冷的0.1 mol/L乙酸銨的甲醇溶液來沉淀蛋白質(zhì)。在-20℃過夜, 蛋白形成白色沉淀(對大多數(shù)蛋白來說30 min可以沉淀, 一般來說過夜沉淀操作方便, 沉淀完全)。

(7) 5 000～10 000 g, 4℃離心30 min, 用槍頭小心吸取上清并丟棄。

(8) 加入兩倍體積的冰預(yù)冷甲醇來清洗沉淀(基于最后收集的酚相的體積), 輕輕混勻, 5 000～10 000 g, 4℃離心30 min, 用槍頭小心吸取上清并丟棄。

(9) 重復(fù)步驟8兩次。目的是為了除掉乙酸銨和酚, 脂類以及色素。

(10) 使用丙酮代替甲醇重復(fù)步驟9兩次, 方便除掉甲醇并使沉淀更快更有效的干燥。

(11) 把沉淀晾干(如果有顏色, 說明存在色素或氧化的酚類化合物污染, 可以重新用酚提取, 但是要注意蛋白的損失)。

其二，已有研究表明，教師在理解和講授統(tǒng)計和概率方面存在許多困難，其主要難點在于數(shù)據(jù)分析觀念的滲透，這就需要教師不斷提高自己的專業(yè)素養(yǎng).首先，教師自身需要有數(shù)據(jù)分析觀念的意識.其次，教師應(yīng)具備引導(dǎo)學(xué)生形成數(shù)據(jù)分析觀念的能力.因此，如何對教師進行統(tǒng)計教育和培訓(xùn)是一個巨大的挑戰(zhàn).職前教師教育應(yīng)加強理論和應(yīng)用統(tǒng)計學(xué)的學(xué)習(xí)，培養(yǎng)統(tǒng)計思維和教學(xué)觀念等.在職教師培訓(xùn)應(yīng)以實際問題為導(dǎo)向，注重教師的實踐經(jīng)驗，合作學(xué)習(xí)和交流，從而使教師能夠自我分析和反思.

(12) 把粉末轉(zhuǎn)移到1.5 mL離心管中, 加裂解液溶解, 離心取上清測蛋白濃度。

(13)可用超濾管濃縮至所需濃度, 凍存在-20℃或者－80℃。

1.4 蛋白濃度測定

參照Bradford方法[14]測定提取的條斑紫菜葉狀體總蛋白質(zhì)濃度。

1.5 雙向電泳

等電聚焦: 采用 IPGphor等電聚焦系統(tǒng), 17 cm 的 IPG膠條, pH=3～10。

(1)取凍存蛋白溶解和上樣緩沖液按1:4比例上樣, 離心15 000 r/min, 30 min, 17 cm膠條上樣1 mg蛋白和緩沖液混合后總體積300～600 μL。

(2)上樣, 取膠條至于聚焦盤里吸收液體 1 h。然后覆蓋礦物油, 50 V電壓下主動水化 16 h, 水化結(jié)束后用洗瓶沖洗膠條兩次, 把膠條背面放在濾紙上吸去多余水分和礦物油, 放到另一根槽里, 分別用濕潤濾紙做鹽橋, 覆蓋礦物油, 進行聚焦。等電聚焦參數(shù)如表1:

表1 等電聚焦電泳(IEF)參數(shù) Tab. 1 The parameters of isoelectric focusing electrophoresis (IEF)

SDS-PAGE電泳: 使用 DALT—Six系統(tǒng), 進行 SDS-PAGE電泳。溫度 l5℃, 80V×30min, 200 V電泳至溴酚蘭前沿剛好跑出凝膠。

1.6 凝膠染色及分析

染色采用改進的膠體考馬斯亮藍染色法[15], 圖像掃描采用BioRad GS-800, 軟件分析采用PDQuest 2-DE 8.0.1。

2 結(jié)果

2.1 3種方法提取條斑紫菜葉狀體總蛋白的圖譜結(jié)果

通過雙向電泳分析, 比較了3種方法的提取效果, 由圖1可以看出飽和硫酸銨沉淀法和三氯乙酸/丙酮沉淀法所得圖譜結(jié)果比較相近, 背景比較重, 在酸性區(qū)聚焦不是很好, 低分子量區(qū)域出現(xiàn)橫向條紋及不規(guī)則的蛋白點, 蛋白集中度高, 使多個蛋白點連在一起或成線狀, 形成拖尾和糊狀使蛋白點的等電點難以確定, 影響蛋白質(zhì)的分布和觀察, 尤其在堿性端出現(xiàn)大量空白幾乎無蛋白質(zhì)點出現(xiàn), 而且在高分子量區(qū)也只檢測到很少的幾個蛋白質(zhì)點。酚提取方法所得到的圖譜背景干凈, 分離效果比較理想, 基本沒有縱向條紋, 橫向擴散也很輕微。蛋白質(zhì)點較多, 尤其在堿性范圍內(nèi)和高分子量區(qū)域的蛋白質(zhì)點較另兩種法明顯增多而且蛋白質(zhì)點比較清晰, 大多數(shù)蛋白質(zhì)點呈圓形或橢圓形, 清晰可見。這說明飽和硫酸銨沉淀法和三氯乙酸/丙酮沉淀法所得到的樣品中鹽離子和其他干擾雜質(zhì)比較多, 而酚提取方法則能很好的除掉這些鹽離子和雜質(zhì), 保證聚焦的順利進行。

2.2 3種提取方法獲得的蛋白量差異比較

蛋白質(zhì)獲得量及純度的高低是檢驗提取方法優(yōu)劣的主要指標(biāo)。圖2和圖3對3種提取方法分別從1 g材料所獲得的粗蛋白量、純蛋白量以及蛋白質(zhì)純度等進行比較分析。數(shù)據(jù)顯示, 在蛋白獲得量方面, 飽和硫酸銨沉淀法獲得的粗蛋白量最高, 其次是三氯乙酸/丙酮沉淀法, 酚提取方法所得含量最低; 而3種方法所獲得的純蛋白量比較, 酚提取方法遠遠高于其他兩種方法。蛋白質(zhì)純度是影響電泳結(jié)果的關(guān)鍵因素, 從蛋白純度這方面來看, 酚提取方法也要遠遠高于其他兩種方法, 這可能與提取方法的除雜效果有關(guān)。由這種結(jié)果可以看出, 飽和硫酸銨沉淀法去除樣品雜質(zhì)不完全, 提取率較低; 三氯乙酸/丙酮沉淀法獲得的蛋白樣品純度可以, 但可能會對樣品蛋白造成的損失較大; 酚提取方法獲得的蛋白樣品純度較高, 雜質(zhì)處理較好。

2.3 3種方法所得圖譜在蛋白點的數(shù)目比較

飽和硫酸銨沉淀法和三氯乙酸/丙酮沉淀法取的樣品中大部分蛋白質(zhì)已丟失, 雜質(zhì)太多, 蛋白質(zhì)斑點比較少, 分別為163和178; 酚提取方法使蛋白質(zhì)組分得到有效分離, 蛋白質(zhì)樣品的雜質(zhì)大大減少, 能檢測出587個點。由此可見飽和硫酸銨法雜質(zhì)難除, 影響電泳; 三氯乙酸/丙酮沉淀法, 變性沉淀的蛋白質(zhì)使沉淀后的蛋白溶解比較困難, 導(dǎo)致蛋白的大量損失; 酚提取方法除雜效果較其他兩種方法好, 所提蛋白質(zhì)純度高, 所得到蛋白點較多, 能反映出蛋白點的分布。

圖l 條斑紫菜葉狀體總蛋白的提取 Fig. 1 Total proteins extracted from thalli of Porphyra yezoensis

圖2 不同提取方法蛋白量比較 Fig. 2 Comparison of the crude protein yields by different extration methods

圖3 不同提取方法蛋白量比較 Fig. 3 Comparison of the pure protein yields by different extration methods

圖4 3種方法所得蛋白點數(shù)比較 Fig. 4 Classification of protein spots with different extration methods

3 討論

樣品制備是雙向電泳的第一步, 其成功與否是決定雙向電泳成敗的關(guān)鍵。蛋白提取過程有幾條原則需要遵循: (1)盡可能溶解全部蛋白質(zhì), 打斷蛋白質(zhì)之間的非共價鍵結(jié)合, 使樣品中的蛋白質(zhì)以分離的多肽鏈形式存在; (2)避免蛋白質(zhì)的修飾作用和蛋白質(zhì)的降解作用; (3) 避免脂類、核酸、鹽等物質(zhì)的干擾作用; (4)蛋白質(zhì)樣品與第一向電泳的相容性[16]。近年來雙向電泳技術(shù)在植物應(yīng)用中不少報道, 但大部分集中在一些高等模式生物上, 對于條斑紫菜的應(yīng)用還沒見報道, 條斑紫菜富含色素, 多酚, 多糖等次生代謝產(chǎn)物和大量鹽分, 其蛋白樣品制備相對于其他植物更加困難。

本實驗分別采用了飽和硫酸銨沉淀法、三氯乙酸-丙酮沉淀法、酚提取法提取蛋白。結(jié)果顯示飽和硫酸銨沉淀法所得蛋白樣品中殘留雜質(zhì)太多, 最終蛋白樣品在進行第一向電泳時無法很好聚焦, 影響了電泳, 使最終圖譜結(jié)果不理想。三氯乙酸-丙酮沉淀法則較好解決了以上的鹽離子濃度高的難題, 制備過程也相對簡單, 但蛋白質(zhì)沉淀下來后較難重懸, 樣品得率較低。酚提取法采用先溶解提取蛋白質(zhì), 然后再沉淀離心的方法, 在提取上利用Tris一飽和酚的特性, 即酚是蛋白質(zhì)的良好溶劑, 在樣品制備過程中, 蛋白質(zhì)和脂類溶于酚相, 鹽、核酸、多酚和多糖等可溶性物質(zhì)進入水相, 與酚相中的蛋白質(zhì)分開[12], 另外, 在實驗過程中加入PVPP可以有效的去除多 酚[11], 使所得蛋白樣品受多糖、色素、脂類、核酸、鹽等物質(zhì)的干擾最小, 得到的電泳圖譜最理想, 很多富含多糖植物組織蛋白質(zhì)的提取一般采用酚提取法, 另外在3種方法所獲得粗蛋白質(zhì)量和蛋白點數(shù)目的比較上, 直觀地看出相比于前兩種方法, 酚提取方法和發(fā)現(xiàn)酚提取法能更好地提取蛋白和除去樣品的鹽離子及其他干擾雜質(zhì), 獲得的蛋白樣品純度較高, 為提高其他大型海藻的總可溶性蛋白提取提供了重要參考。

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