黃 浩，許國(guó)權(quán)，周世力

（江漢大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，湖北 武漢 430056）

靈芝（Ganodermalucidum）是一種著名的藥用真菌，對(duì)其生物學(xué)功能的研究推動(dòng)了靈芝產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，我國(guó)真菌登記分類還未成體系，因?yàn)榫N問(wèn)題而造成了管理混亂、產(chǎn)品質(zhì)量不穩(wěn)定等問(wèn)題［1］。傳統(tǒng)的分類鑒定主要依據(jù)子實(shí)體的形態(tài)學(xué)特征來(lái)進(jìn)行，但是由于生長(zhǎng)條件的不同導(dǎo)致子實(shí)體的形態(tài)學(xué)特征發(fā)生變化，一些鑒別性特征在不同種屬間的差異較小，這是傳統(tǒng)分類學(xué)的一個(gè)弊端［2］。近年來(lái)，在分子水平上對(duì)靈芝分類研究已經(jīng)取得了不少進(jìn)展，J.M.Moncalvo 等［3］通過(guò)rDNA的ITS 序列和25SrDNA D2 變異區(qū)序列對(duì)靈芝科的菌株進(jìn)行了分類研究，鑒定了4 個(gè)系統(tǒng)發(fā)育學(xué)上的相關(guān)族（relatedclusters）。蘇春麗等［4］利用β－微管蛋白基因部分序列探討靈芝屬菌株的親緣關(guān)系。唐傳紅等［5］利用RAPD 和酯酶同工酶技術(shù)對(duì)來(lái)自國(guó)內(nèi)外的10 個(gè)靈芝屬代表菌株進(jìn)行了遺傳多樣性分析。其中RAPD 分析主要用于種間親緣關(guān)系的研究和分類鑒定，在靈芝屬中的研究較少［6］。ITS 序列分析在真菌屬內(nèi)種間的系統(tǒng)發(fā)育研究中應(yīng)用較為廣泛［7］。更為保守的18SrDNA則主要應(yīng)用于目、科、屬等分類元階［8］。目前，中國(guó)常見(jiàn)的靈芝栽培品種多以商品名命名，具體分類學(xué)還不明確，品種鑒定也單方面?zhèn)戎赜赗APD［9］或ITS 分子標(biāo)記技術(shù)，每種方法都有其局限性，筆者嘗試將RAPD 與rDNA 上的ITS 序列和18SrDNA 片段分子標(biāo)記技術(shù)結(jié)合起來(lái)，比較之間的結(jié)果，分析可能存在的差異，為精確探索靈芝分類提供一些借鑒。

1 材料和方法

1.1 材料

1.1.1 供試菌株 由江漢大學(xué)食用菌栽培實(shí)驗(yàn)室提供6 個(gè)靈芝菌種，分別為甜芝、紫芝、黑芝、血芝、云芝和韓芝（見(jiàn)表1）。

表1 供試菌株

1.1.2 培養(yǎng)基 馬鈴薯固體培養(yǎng)基，馬鈴薯200 g/L，葡萄糖20 g/L，瓊脂糖0.8%。

1.1.3 主要試劑和儀器 真菌基因組提取試劑盒（BioFlux）；PCR 反應(yīng)試劑盒（Fermentas）；DNA 割膠回收試劑盒（BioFlux）；連接反應(yīng)體系（Promega）；質(zhì)粒提取試劑盒（BioFlux）；冷凍離心機(jī)（Eppendorf）；PCR 儀（Eppendorf）。

1.1.4 引物 RAPD 分析所用的10 堿基SBS 系列隨機(jī)引物購(gòu)自上海賽百盛公司，ITS 和18SrDNA分析所用的引物ITS1/ITS4 和NS5/NS6 均購(gòu)自上海生工公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 菌絲體培養(yǎng)和基因組提取 靈芝的菌絲體于28 ℃固體培養(yǎng)基培養(yǎng)10 d。收集菌絲，－20 ℃下保存?zhèn)溆?。DNA 提取參照唐傳紅等［10］的方法進(jìn)行，得到的DNA 溶液在1 %的瓊脂糖凝膠上電泳檢測(cè)。

1.2.2 RAPD 多態(tài)性分析 PCR 擴(kuò)增儀為PTC－100 型。PCR 反應(yīng)體系：10×Buffer 5μL，dNTP 4 μL，MgCl23 μL，隨機(jī)引物2 μL，模板1μL，Taq聚合酶0.5 μL，dd H2O 定容至50 μL。反應(yīng)參數(shù)為：94 ℃條件模板DNA 變性5 min，94 ℃變性45 s，53 ℃退火45 s，72 ℃延伸90 s，循環(huán)擴(kuò)增40 次，最后在72 ℃條件下進(jìn)行延伸7 min，于4 ℃結(jié)束反應(yīng)。取5 μL 的擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1 %的瓊脂糖凝膠電泳（5 V/cm）30 min，EB 染色后置于凝膠成像系統(tǒng)照相。通過(guò)對(duì)80 個(gè)隨機(jī)引物進(jìn)行RAPD分析，篩選出12 個(gè)能有效擴(kuò)增且穩(wěn)定性較好的隨機(jī)引物（見(jiàn)表2）用于進(jìn)一步分析。

1.2.3 ITS－PCR 擴(kuò)增 擴(kuò)增體系為：10×Buffer 5 μL，dNTP 4 μL，MgCl23 μL，ITS1/ITS4 引物各1 μL，模板1μL，Taq 聚合酶0.5 μL，dd H2O 定容至50 μL。反應(yīng)參數(shù)為：94 ℃條件模板DNA 變性5 min，94 ℃變性30 s，54 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，循環(huán)擴(kuò)增30 次，最后在72 ℃條件下進(jìn)行延伸7 min，于4 ℃結(jié)束反應(yīng)。

表2 隨機(jī)引物編號(hào)及核苷酸序列（5′一3′）

1.2.4 18SrDNA 片段的擴(kuò)增 擴(kuò)增體系為：10×Buffer 5 μL，dNTP 4 μL，MgCl23 μL，NS5/NS6 引物各1 μL，模板1 μL，Taq 聚合酶0.5 μL，dd H2O定容至50 μL。反應(yīng)參數(shù)為：94 ℃條件模板DNA變性5 min，94 ℃變性30 s，53 ℃退火30 s，72 ℃延伸60 s，循環(huán)擴(kuò)增30 次，最后在72 ℃條件下進(jìn)行延伸7 min，于4 ℃結(jié)束反應(yīng)。

1.2.5 rDNA ITS 片段和18SrDNA 片段的序列測(cè)定 ITS 擴(kuò)增產(chǎn)物通過(guò)DNA 凝膠回收試劑盒純化，用Promega 的pGEM－T Easy Vector連接，轉(zhuǎn)化于大腸埃希菌DH 5α菌株感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)藍(lán)白斑篩選和PCR 鑒定后，每個(gè)樣品隨機(jī)挑選1 個(gè)陽(yáng)性單克隆株測(cè)序。

1.3 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與分析方法

RAPD 數(shù)據(jù)分析：定義RAPD－PCR 圖譜中不同分子量的DNA 條帶為多態(tài)性狀，有性狀記為1，無(wú)性狀記為0，并轉(zhuǎn)換為對(duì)應(yīng)數(shù)字矩陣。用NTSYSpc2.1 版軟件包（Exeter Software：Setauket，NY，USA），UPGMA 法聚類分析，獲得親緣關(guān)系樹(shù)狀圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 RAPD 多態(tài)性分析

用篩選出的12 個(gè)隨機(jī)引物對(duì)6 種供試材料進(jìn)行RAPD 多態(tài)性分析。結(jié)果顯示，引物與供試材料在不同對(duì)應(yīng)水平上的擴(kuò)增效果均存在差異，（圖1）。每一引物對(duì)每種供試材料擴(kuò)增的條帶數(shù)介于0～15 條，DNA 片段的大小介于0.2～2.0 kb，12 個(gè)引物對(duì)6 種供試材料擴(kuò)增產(chǎn)生近91 條DNA片段。這些數(shù)據(jù)用于對(duì)6 種靈芝菌株進(jìn)行相似性分析并構(gòu)建親緣關(guān)系樹(shù)。

圖1 6 種靈芝菌株的RAPD-PCR 圖譜

2.2 聚類分析

依照1.3 的方法，將6 種靈芝分析獲得的RAPD－PCR 圖譜轉(zhuǎn)換為數(shù)字矩陣，計(jì)算對(duì)應(yīng)分離菌株間的Dice 相似系數(shù)，得出6 種靈芝菌株的平均遺傳距離矩陣（見(jiàn)表3），6 種靈芝菌株兩兩間的相似性系數(shù)為0. 396～0. 747。其中Ganodermasinenses 和Ganodermaatrum 的相似系數(shù)最高，達(dá)0. 747；而Xuezhi 和Coriolusversicolor 的相似系數(shù)最低，為0.396。用UPGMA 法進(jìn)行聚類分析。結(jié)果顯示，6 種菌株在相似性系數(shù)為0. 584 的水平上聚為3 類：Ganodermaluidun、Ganodermaluidum-HG、Ganodermasinenses 和Ganodermaatrum 為一類；Xuezhi和Coriolusversicolor各單歸為一類。

表3 6 種靈芝菌株的平均遺傳相似性距離矩陣

2.3 18SrDNA 序列分析

6 種靈芝菌株的18SrDNA 擴(kuò)增片段，其測(cè)序結(jié)果通過(guò)DNASTAR 軟件包中的MegAlign 程序進(jìn)行序列分析（見(jiàn)圖2）。結(jié)果表明，不同靈芝菌株間相似性都比較高（97.1%～99.6%），其中Xuezhi和GanodermaluidumHG 相似性最高，達(dá)99. 6 %；在較低相似性水平上，6 種靈芝菌株可分為3 類，Ganodermaluidun、Ganodermaatrum 和Coriolusversicolor歸為一類，GanodermaluidumHG 和Xuezhi歸為一類，Ganodermasinenses單歸為一類。

圖2 6 種靈芝菌株的18SrDNA 序列比較的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.4 ITS 序列分析

4 種靈芝菌株的ITS 片段測(cè)序成功，測(cè)序結(jié)果通過(guò)DNASTAR 軟件包中的MegAlign 程序進(jìn)行序列分析（見(jiàn)圖3）。結(jié)果表明，靈芝菌株間相似性較低（43. 8 %～88. 0 %），其中Ganodermasinenses 和Xuezhi 相似性最低，為43. 8 %；在較低相似性水平上，Ganodermaluidun 和Ganodermasinenses 歸為一類，Coriolusversicolor 和Xuezhi 各單歸為一類。

圖3 4 種靈芝菌株的ITS 序列比較的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

3 討論

RAPD 在真菌分類研究中已有廣泛的應(yīng)用，據(jù)不完全統(tǒng)計(jì)，RAPD 已在鏈格孢屬（Alternaria）、葡萄孢屬（Botrytis）、發(fā)癬菌屬（Tnchophyton）、芽枝霉屬（Cladosporium）、炭疽菌屬（Colletotrichum）、頂囊殼屬（Gaeumannomyces）、組織胞漿菌屬（Histoplasma）、球腔菌屬（Mycosphaerella）、莖點(diǎn)霉屬（Phoma）、側(cè)耳屬（Pleurotus）、絲核菌屬（Rhizoctonia）、腥黑粉菌屬（Tilletia）等50 余個(gè)屬的種類區(qū)分或疑難種鑒定上得到應(yīng)用［9］。RAPD 技術(shù)已經(jīng)成功用于一些靈芝屬不同種的區(qū)分，趙明文等［6］利用RAPD 技術(shù)對(duì)生產(chǎn)中常用的靈芝屬8 個(gè)菌株的親緣關(guān)系進(jìn)行了分析，結(jié)果與經(jīng)典分類結(jié)果基本相符。唐傳紅等［10］也證實(shí)了RAPD 可用于靈芝屬內(nèi)甚至種內(nèi)的鑒定。本研究中，通過(guò)優(yōu)化篩選12 個(gè)隨機(jī)引物對(duì)6 個(gè)菌株進(jìn)行RAPD 分析，結(jié)果顯示，6 種菌株在相似性系數(shù)為0. 584 的水平上聚為3 類：Ganodermaluidun、GanodermaluidumHG、Ganodermasinenses 和Ganodermaatrum 為一類；Xuezhi 和Coriolusversicolor 各單歸為一類。

ITS 序列分析是真菌分類研究中最常用方法之一。J. M. Moncalvo 等［3］和B. J. Smith 等［11］通過(guò)ITS 序列分析對(duì)靈芝屬菌株進(jìn)行了一些分類研究，證實(shí)了ITS 序列分析是一種有效方法。在本研究中，ITS 序列分析的3 個(gè)類群（Ganodermaluidun/Ganodermasinenses、Coriolusversicolor 和Xuezhi）與RAPD 分析的3 個(gè)類群（Ganodermaluidun/GanodermaluidumHG/Ganodermasinenses/Ganodermaatrum、Coriolusversicolor 和Xuezhi）基本一致，其中，屬于多孔菌科云芝屬的Coriolusversicolor 與屬于靈芝屬的Ganodermaluidun、Ganodermaluidum-HG、Ganodermasinenses 和Ganodermaatrum 與傳統(tǒng)形態(tài)學(xué)分類基本一致，而分類地位不明的Xuezhi與其他菌株差異性較大，說(shuō)明Xuezhi 應(yīng)屬于靈芝屬與云芝屬以外其他屬類。

目前普遍認(rèn)為18SrDNA 可用于科級(jí)以上水平的系統(tǒng)發(fā)育分析，如鄧旺秋等［12］以短裙竹蓀和白鬼筆作為鬼筆目的代表種，將其部分18SrDNA序列與擔(dān)子菌門其他科目12 個(gè)代表種已知的相關(guān)序列進(jìn)行對(duì)比分析，構(gòu)建系統(tǒng)樹(shù)，探討鬼筆目在系統(tǒng)分類學(xué)中的地位及其親緣關(guān)系?？紤]到某些物種的18SrDNA 可能具有其他物種所沒(méi)有的高度變異擴(kuò)展區(qū)，而這些區(qū)域又是用于近緣種間關(guān)系分析與分類的關(guān)鍵，因此有學(xué)者認(rèn)為，在亞族和屬的水平上處理系統(tǒng)關(guān)系也能得出理想結(jié)果［13］，如余知和等［14］利用18SrRNA 基因核苷酸序列分析方法探討了晶杯菌科粒毛盤菌屬及其相關(guān)屬間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。據(jù)此，本研究嘗試對(duì)分屬于靈芝屬（Ganodermaluidun、Ganodermaatrum、GanodermaluidumHG 和Ganodermasinenses）、云芝屬（Coriolusversicolor）和分類地位不明的Xuezhi 6種菌株進(jìn)行18SrDNA 序列分析，結(jié)果顯示，在較低相似性水平上，6 種靈芝菌株可分為3 類，Ganodermaluidun、Ganodermaatrum 和Coriolusversicolor歸為一類，GanodermaluidumHG 和Xuezhi歸為一類，Ganodermasinenses單歸為一類。18SrDNA分析的3 個(gè)分類群與另外兩種方法的分析結(jié)果有很大差異，可以說(shuō)明，18SrDNA 并不太適合靈芝屬屬內(nèi)和屬間的分類研究。不可否認(rèn)，RAPD 和ITS 分子標(biāo)記各自也存在一些缺點(diǎn)，但在本研究?jī)烧叻治鼋Y(jié)果基本一致的基礎(chǔ)上，可以考慮在靈芝屬的分類研究中將兩種技術(shù)結(jié)合起來(lái)，較之于單一技術(shù)，會(huì)更接近于實(shí)際情況。

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