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(1 青島市市立醫(yī)院檢驗(yàn)科，山東 青島 266011; 2 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)教研室)

丹參用于治療冠狀動(dòng)脈疾病和腦血管疾病也有逾千年的歷史。從丹參根莖提取的丹參酮ⅡA(TanⅡA)是一種含有醌型結(jié)構(gòu)的脂溶性成分，具有傳遞電子的作用，表現(xiàn)出多種生物活性[1]。我們的前期研究顯示,TanⅡA能降低bcl-2/bax比值，促使HeLa細(xì)胞發(fā)生凋亡[2]。TanⅡA究竟從何途徑促使HeLa細(xì)胞發(fā)生凋亡目前所知甚少。線粒體通路是細(xì)胞凋亡發(fā)生的機(jī)制之一。本研究觀察TanⅡA作用下HeLa細(xì)胞發(fā)生凋亡的特點(diǎn)，從分子水平揭示TanⅡA所致HeLa細(xì)胞凋亡的發(fā)生機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

新生牛血清、DMEM培養(yǎng)基為Gibco公司產(chǎn)品。細(xì)胞色素C(Cyto C)檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Biovision公司，化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒購(gòu)自Santacruz公司。線粒體膜電位檢測(cè)試劑盒(JC-1)購(gòu)自碧云天公司。人宮頸癌細(xì)胞HeLa細(xì)胞株來(lái)自中國(guó)協(xié)和醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)學(xué)院細(xì)胞中心。TanⅡA來(lái)自中國(guó)藥品生物制品檢定所。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1細(xì)胞培養(yǎng)和藥物處理 HeLa細(xì)胞在含體積分?jǐn)?shù)0.10新生牛血清的DMEM 培養(yǎng)基(含青霉素100 kU/L，鏈霉素100 mg/L)，體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2、37 ℃條件下常規(guī)培養(yǎng)，細(xì)胞在對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期時(shí)進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，調(diào)整細(xì)胞密度為2×107/L進(jìn)行接種。TanⅡA溶于二甲基亞砜(DMSO)中，配成200 mg/L的溶液，過(guò)濾除菌保存，實(shí)驗(yàn)時(shí)用適量的培養(yǎng)液稀釋至終濃度1.0、2.0、4.0 mg/L。實(shí)驗(yàn)同時(shí)設(shè)立空白對(duì)照組(未加TanⅡA，其他條件完全一致)以及DMSO對(duì)照組(DMSO體積分?jǐn)?shù)為0.02)。

1.2.2流式細(xì)胞儀檢測(cè)HeLa細(xì)胞凋亡 TanⅡA處理48 h后收集細(xì)胞，在含Annexin V和碘化丙啶(PI)的雙標(biāo)記液中室溫孵育20 min后，上流式細(xì)胞儀進(jìn)行檢測(cè)。用分析軟件Cellquest獲取數(shù)據(jù)，計(jì)算凋亡率。

1.2.3Western印跡法檢測(cè) Cyto C分別提取HeLa細(xì)胞細(xì)胞質(zhì)、線粒體蛋白質(zhì)，定量后行SDS-PAGE凝膠電泳，用電轉(zhuǎn)印儀將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)印到PVDF膜，轉(zhuǎn)印后的膜依次加入1∶200稀釋的一抗、1∶1 000稀釋的二抗孵育，化學(xué)發(fā)光法顯色曝光，天能分析軟件分析各蛋白條帶灰度值，結(jié)果以Cyto C/β-actin比值表示。

1.2.4流式細(xì)胞儀檢測(cè)線粒體膜電位 TanⅡA處理48 h后收集細(xì)胞，應(yīng)用JC-1染色液37 ℃孵育20 min后，上流式細(xì)胞儀檢測(cè)，用ModFit V 1.2軟件分析。正常細(xì)胞的線粒體膜電位電壓較高，可形成JC-1的聚集體，發(fā)出紅色熒光；而線粒體膜電位降低的細(xì)胞，則會(huì)形成JC-1單體，發(fā)出綠色熒光。

2 結(jié) 果

2.1 TanⅡA作用后HeLa細(xì)胞凋亡情況

以1.0、2.0、4.0 mg/L的TanⅡA作用48 h后，HeLa細(xì)胞凋亡率與空白對(duì)照組比較，TanⅡA不同濃度組間比較，差異均有顯著性(F=987.9，q=10.08～75.38，P<0.01)；而DMSO對(duì)照組與空白對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

2.2 TanⅡA作用后HeLa細(xì)胞Cyto C的變化

與空白對(duì)照組相比，TanⅡA各劑量組細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)Cyto C表達(dá)明顯增高(F=216.5，q=13.47～29.39，P<0.01)，線粒體內(nèi)的Cyto C表達(dá)則明顯降低(F=1 064.6，q=4.11～68.47，P<0.01)；而DMSO對(duì)照組與空白對(duì)照組比較，差異無(wú)顯著意義(P>0.05)。見(jiàn)表1。

表1 不同濃度Tan ⅡA作用后HeLa細(xì)胞凋亡率及Cyto C表達(dá)比較

2.3 TanⅡA作用后線粒體膜電位的變化

與空白對(duì)照組和DMSO對(duì)照組比較，1.0、2.0、4.0 mg/L TanⅡA作用HeLa細(xì)胞48 h后，正常細(xì)胞(線粒體膜電位電壓較高)的數(shù)量減少，而線粒體膜電位降低的細(xì)胞數(shù)量增加，差異均有顯著性(F=

116.5、116.5，q=5.79～24.56，P<0.01)。另外，DMSO對(duì)照組與空白對(duì)照組比較，差異無(wú)顯著性(P>0.05)。見(jiàn)表2。

表2 不同濃度Tan ⅡA作用后HeLa細(xì)胞線粒體膜電位比較

3 討 論

多項(xiàng)體外實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TanⅡA對(duì)乳癌、肺癌、白血病等多種腫瘤細(xì)胞具有抑制增殖、誘導(dǎo)凋亡的作用[3]。本文結(jié)果顯示，不同濃度TanⅡA作用HeLa細(xì)胞能有效地誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，凋亡率呈劑量依賴性。抑制細(xì)胞凋亡是腫瘤的標(biāo)志性特征之一，故誘導(dǎo)腫瘤細(xì)胞凋亡已成為一種有效的腫瘤治療的策略與途徑[4]。過(guò)去人們認(rèn)為，凋亡主要是由細(xì)胞核的改變引起，現(xiàn)在研究顯示線粒體是細(xì)胞存亡的控制中心[5]，線粒體膜電位降低是凋亡的一個(gè)早期事件，在凋亡過(guò)程中由于線粒體呼吸鏈電子傳遞被中斷，產(chǎn)生自由基，影響能量供應(yīng)，線粒體膜完整性受到破壞，這些都發(fā)生在經(jīng)典的細(xì)胞凋亡特征出現(xiàn)以前。我們前期的研究結(jié)果顯示，TanⅡA能降低bcl-2/bax比值，而在生物系統(tǒng)中，異常表達(dá)的bcl-2、bax可能引起細(xì)胞線粒體結(jié)構(gòu)的破壞，促使Cyto C釋放進(jìn)入細(xì)胞質(zhì)，最終導(dǎo)致細(xì)胞凋亡。此途徑也可能參與了TanⅡA誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡的過(guò)程。

JC-1即四氯四乙基苯并咪唑基羰花青碘化物，是一種廣泛用于檢測(cè)細(xì)胞、組織或純化的線粒體膜電位的理想熒光探針。通過(guò)JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變可以很容易地檢測(cè)到線粒體膜電位的下降，線粒體膜電位的下降是細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)標(biāo)志性事件，同時(shí)也可以將JC-1從紅色熒光到綠色熒光的轉(zhuǎn)變作為細(xì)胞凋亡早期的一個(gè)檢測(cè)指標(biāo)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，TanⅡA作用HeLa細(xì)胞48 h后，線粒體膜電位降低，且呈明顯的劑量依賴效應(yīng)。

Cyto C正常定位于線粒體膜間隙中，不能通過(guò)線粒體外膜，因此不能在細(xì)胞質(zhì)中檢測(cè)到。線粒體結(jié)構(gòu)破壞，線粒體外膜通透性增高，促使Cyto C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中。Cyto C從線粒體釋放至

胞質(zhì)是引發(fā)凋亡關(guān)鍵步驟。本文研究結(jié)果顯示，TanⅡA 作用HeLa細(xì)胞48 h后，與空白對(duì)照組相比，正常細(xì)胞(紅色細(xì)胞)的數(shù)量減少，線粒體膜電位降低細(xì)胞(綠色細(xì)胞)數(shù)量增加；細(xì)胞胞質(zhì)內(nèi)Cyto C表達(dá)明顯增高，線粒體內(nèi)Cyto C表達(dá)明顯降低，并且該作用呈劑量依賴性。

綜上所述，TanⅡA能有效地降低HeLa細(xì)胞線粒體膜電位，促進(jìn)Cyto C從線粒體釋放到細(xì)胞質(zhì)中，線粒體途徑可能是TanⅡA誘導(dǎo)HeLa細(xì)胞凋亡的機(jī)制之一，但其具體作用機(jī)制還有待進(jìn)一步研究。盡管如此，丹參有希望成為臨床治療腫瘤的輔助用藥。

[1] 景莉,王秦,李曉明. 丹參酮ⅡA 對(duì)急性早幼粒細(xì)胞白血病作用的研究進(jìn)展[J]. 中國(guó)藥房, 2006,17(12):942-943.

[2] 沈雋,王照艷,張曉,等. 丹參酮ⅡA對(duì)HeLa宮頸癌細(xì)胞凋亡的影響[J]. 中國(guó)藥房, 2007,18(27):2102-2104.

[3] 翟學(xué)敏,和水祥,任牡丹,等. 丹參酮ⅡA對(duì)人肝癌SMMC-7721細(xì)胞EGF及其受體表達(dá)的影響[J]. 浙江大學(xué)學(xué)報(bào):醫(yī)學(xué)版, 2009,38(2):163-169.

[4] 孟顯峰,宋揚(yáng),楊偉品. IP6誘導(dǎo)肝癌細(xì)胞HepG2凋亡及其對(duì)Bcl-2和Bax蛋白表達(dá)影響[J]. 青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院學(xué)報(bào), 2011,47(4):37-39.

[5] 張曉妮,冷傳禮,宋揚(yáng). IP6誘導(dǎo)HT-29細(xì)胞凋亡中線粒體通路的實(shí)驗(yàn)研究[J]. 齊魯醫(yī)學(xué)雜志, 2009,24(4):319-323.