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(青島大學醫(yī)學院附屬醫(yī)院病理科，山東 青島 266003)

β-連環(huán)蛋白(β-catenin)在細胞中起兩個作用：一是作為細胞黏附或肌動蛋白細胞骨架網絡的結構組分；二是游離的β-catenin作為信號轉導分子在基因轉錄中起作用。這兩種作用均與腫瘤的演進異質化過程有關。目前，對胃癌β-catenin的研究多側重于蛋白表達水平，而其結構改變對于胃癌演進異質化的影響報道較少[1]。本研究采用聚合酶鏈反應(PCR)-單鏈構象多態(tài)性(SSCP)方法及DNA序列分析法，分析胃癌β-catenin的exon3基因突變及其蛋白表達情況，從基因水平和蛋白水平探討胃癌β-catenin功能異常的調控機制?，F(xiàn)將結果報告如下。

1 資料與方法

1.1 標本及其來源

收集我科2011年9—11月間的新鮮胃癌手術切除標本35例，癌周正常黏膜(距腫瘤邊緣≥5 cm)組織10例。根據(jù)日本胃癌研究會1995年的分型方案，中分化腺癌6例，低分化腺癌22例，黏液腺癌5例，印戒細胞癌2例。按Lauren分型方法，腸型6例，混合型4例，彌漫型25例。

1.2 PCR-SSCP方法

1.2.1DNA提取 取液氮保存的新鮮手術標本約1 g，加入4 μL的蛋白酶K(終濃度為0.1 g/L)和DNA提取緩沖液500 μL，55 ℃溫浴3 h，酚-氯仿-異戊醇抽提，冰無水乙醇沉淀，體積分數(shù)0.75冰乙醇洗滌，重溶于雙蒸水中，置4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2引物設計及合成 β-catenin外顯子3引物序列參考文獻[2]設計，序列如下：F 5′-CCAATCTACTAATGCTAATACTG-3′(310 bp)，R 5′-CTGCATTCTGACTTTCAGTAAGG-3′。

1.2.3PCR擴增 PCR反應總體積為25 μL,其中含有基因組DNA 500 ng，4×dNTPs 0.25 mmol/L，Mg2+1.5 mol/L，引物各1 μmol/L，TaqDNA聚合酶1 U和10×buffer 2.5 μL。于PCR循環(huán)儀中94 ℃變性75 s,58 ℃(exon3)退火60 s,72 ℃延伸60 s,循環(huán)30次,最后72 ℃延伸5 min。

1.2.4電泳、銀染 取PCR產物2～3 μL加等體積變性緩沖液混勻，沸水中變性10 min，冰上驟冷5 min。快速上樣，行80 g/L非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(丙烯酰胺∶甲雙叉丙烯酰胺=29∶1)。電泳條件:緩沖液1×TBE，環(huán)境溫度4 ℃，恒壓150 V，時間120～180 min。取下凝膠，于固定液(體積分數(shù)0.10乙醇+體積分數(shù)0.005冰醋酸)中固定5～10 min，雙蒸水漂洗兩次；凝膠浸泡于染色液(2 g/L硝酸銀)中5～10 min，雙蒸水漂洗兩次；將凝膠浸泡于顯色液(10 g/L氧化鈉+2 g/L甲醛)中顯色，至出現(xiàn)棕褐色DNA區(qū)帶為止。最后用雙蒸水漂洗，觀察結果。

1.2.5DNA測序 將經SSCP篩選β-catenin編碼基因突變陽性的PCR產物100 μL，送至上海生工測序部測序。

1.3 β-catenin蛋白表達檢測

采用免疫組織化學方法。將石蠟標本切成5～7 μm厚切片，采用PV-9000兩步法染色，DAB顯色，以PBS代替一抗作為陰性對照。兔抗人β-catenin單克隆抗體及PV-9000試劑盒均購于北京中山試劑公司，嚴格按試劑盒說明操作。正常組織β-catenin蛋白陽性表達的細胞膜呈棕黃色染色，免疫陽性染色位于細胞質或細胞核為表達異?；蜿幮訹2]。

2 結 果

2.1 β-catenin的exon3 PCR產物

PCR擴增產物經15 g/L瓊脂糖凝膠電泳證實,每一標本都擴增出β-catenin的exon3(圖1)。

2.2 β-catenin的exon3的SSCP銀染條帶

PCR擴增的雙鏈DNA片段經過變性處理后，β-catenin的exon3可以出現(xiàn)2～4條單鏈帶(exon3 310 bp)(圖2)。本文35例胃癌組織中，僅有1例分化不良型胃癌組織β-catenin的exon3出現(xiàn)了異常條帶(圖3)。

2.3 β-catenin exon3突變

檢測到β-catenin的exon3突變1例，突變類型為插入突變。突變標本在編碼16位點處插入C堿基(圖4)。

①陰性對照；②DL2000 Marker；③、⑤胃癌組織的exon3產物；④、⑥癌旁組織的exon3產物。

①為未變性的DL2000 Marker；②～④為癌旁組織；⑤～⑩為胃癌組織。

①、③～⑨為胃癌組織；②為癌旁組織；⑩為未變性的DL2000 Marker。箭頭所示為β-catenin的exon3的SSCP銀染異常條帶。

圖4 β-catenin exon3突變標本在編碼16位點處插入C堿基

2.4 β-catenin蛋白表達情況

癌周胃組織β-catenin連續(xù)性表達于細胞膜上。胃癌組織中β-catenin在細胞膜表達明顯減弱甚至消失，其中7例(20%)胃癌組織β-catenin在胞漿和胞核內異常蓄積表達，尤其是印戒細胞癌、低分化胃癌和彌散性浸潤的癌細胞β-catenin異常表達率高。

3 討 論

β-catenin通過與E-cadherin胞內肽段結合再與α-catenin結合，介導細胞黏附，同時參與Wnt途徑的信號傳導, β-catenin在細胞內的水平直接反映了Wnt通路的激活水平[4-5]。目前已有研究結果顯示，多種腫瘤β-catenin基因突變、缺失和蛋白表達轉變或轉位；而β-catenin轉位又是細胞向惡性轉變的原因之一，尤其是向細胞核轉移后,該蛋白可通過與轉錄因子Tcf/Lef結合，并調節(jié)靶基因如C-myc、MMP7、ID2、CIM4、EphB2和FGF20等的轉錄活性，啟動靶基因的轉錄，促進細胞的增殖和活化[6-7]。

本文免疫組化檢測結果顯示，胃癌組織細胞中β-catenin異常表達。這種異常表達主要表現(xiàn)在胞漿的蓄積以及出現(xiàn)核定位，同時細胞膜上表達減少。這種異常表達存在多種機制，現(xiàn)在已知的機制主要有β-catenin磷酸化，對其降解的體系如APC、GSK-3β異常，以及β-catenin基因突變。研究β-catenin在細胞胞漿、胞核內的異常蓄積機制將有利于進一步認識惡性腫瘤侵襲、擴散、轉移的機制。

已有研究顯示，大多數(shù)β-catenin突變鄰近或位于磷酸化位點上，而第3外顯子含有編碼絲氨酸和蘇氨酸位點的序列，導致β-catenin磷酸化位點或其附近的氨基酸序列改變。本文對exon3基因突變檢測結果顯示，35例胃癌組織中1例發(fā)生β-catenin的exon3基因突變，免疫組化染色顯示該標本細胞膜β-catenin蛋白表達減少的同時，伴有胞漿、胞核的蓄積，說明該病人既存在β-catenin基因的異常，也可能存在胞漿中游離β-catenin的降解體系異常。β-catenin的exon3基因突變率極低，提示β-catenin基因突變是胃癌中β-catenin異常蓄積的機制之一，但可能不是主要機制。β-catenin基因可能不是胃癌發(fā)生過程中主要的突變基因。

本文7例(20%)胃癌組織出現(xiàn)β-catenin蛋白胞漿、胞核的異位表達，僅檢測到1例基因突變，提示其他原癌基因激活的機制在胃癌發(fā)生發(fā)展過程中起著重要的作用。本研究某些病例β-catenin蛋白在細胞膜中度表達的同時，也出現(xiàn)胞漿的蓄積表達，推測腫瘤細胞胞漿中游離β-catenin的降解體系發(fā)生了異常。

綜上所述，β-catenin是一個與胃癌發(fā)生及發(fā)展較為相關的生物學指標，是反映腫瘤惡性程度和病期早晚的可靠指標，具有臨床應用的價值和潛力。β-catenin表達狀態(tài)可能改變癌細胞的侵襲能力，為研究癌細胞侵襲、轉移提供新的思路；β-catenin表達水平異常有多種機制，提示臨床可從多角度、多層次了解腫瘤的演進和異質化?；蛲蛔兛赡懿皇俏赴┙M織中β-catenin異常蓄積的主要機制。腫瘤發(fā)生過程中β-catenin異常改變的機制及其在腫瘤發(fā)生過程中的作用需進一步研究。

[1] BECKER K F, ATKINSON M J, REICH U, et al. E-cadhe-rin gene mutations provide clues to diffuse type gastric carcinomas[J]. Cancer Research, 1994,54(14):3845-3852.

[2] YUTAKA K, YAE K, MICHIIE S, et al. β-Catenin accumulation and mutation of exon 3 of the β-catenin gene in hepatocellular carcinoma[J]. The Journal of Cancer Research, 1999,90:1301-1309.

[3] 厲建強,王文宏,李玉軍,等. β-cat和cyclin D1表達與胰腺癌臨床病理學的關系[J]. 齊魯醫(yī)學雜志, 2002,17(3):192-194.

[4] JI J F, YAMASHITA T, WANG X W. Wnt/beta-catenin signaling activates microRNA-181 expression in hepatocellular carcinoma[J]. Cell & Bioscience, 2011,1(1):4-9.

[5] GOKHALE A, KUNDER R, GOEL A, et al. Distinctive microRNA signature of medulloblastomas associated with the WNT signaling pathway[J]. Journal of Cancer Research and Therapeutics, 2010,6(4):521-529.

[6] KOTOH M W. FGF, Notch, BMP, and hedgehog signaling pathways during carcinogenesis[J]. Stem Cell Reviews, 2007,3(1):30-38.

[7] 張英,林洪生. Wnt信號轉導通路與腫瘤干細胞[J]. 現(xiàn)代腫瘤醫(yī)學, 2009,17(2):347-350.