陳曉青，黃 丹，柳 威，楊 榮

（江漢大學(xué) 醫(yī)學(xué)院，湖北 武漢 430056）

酸敏感離子通道（Acid－sensing ion channels，ASICs）是一類由胞外酸化所激活的陽離子通道，在中樞和外周神經(jīng)系統(tǒng)中都廣泛表達(dá)，已有的實驗結(jié)果證實，外周神經(jīng)系統(tǒng)的ASICs 與疼痛的產(chǎn)生和傳導(dǎo)密切相關(guān)［1］。

由于炎癥、組織酸化和痛覺三者之間密切的聯(lián)系，外周的ASICs 作為酸感受器可能與炎性痛相關(guān)。當(dāng)注射酸性溶液至人體皮膚中可直接導(dǎo)致皮下組織酸化并伴隨灼熱痛的產(chǎn)生，并且痛的程度也與酸性強(qiáng)度呈正相關(guān)。與此相一致的是ASICs 在脊髓背根（DRG）神經(jīng)元中的傷害性感受器上有著豐富的表達(dá)。研究發(fā)現(xiàn)，炎癥可導(dǎo)致DRG 神經(jīng)元中的ASICs 表達(dá)顯著增加，而非甾體類抗炎止痛藥如阿司匹林等可以對抗DRG 神經(jīng)元ASICs 表達(dá)的增加，也可以直接抑制ASICs 介導(dǎo)的電流［2］。三叉神經(jīng)節(jié)（TG）是和DRG 類似的一種外周感覺神經(jīng)節(jié)，它是頭面部外周信息傳導(dǎo)到腦干的中繼站，在TG 神經(jīng)元上也有對酸刺激敏感的ASICs 的mRNA 的表達(dá)［3］。本研究在大鼠面部炎癥痛模型的基礎(chǔ)上，通過藥理學(xué)結(jié)合行為學(xué)方法，來探討ASICs 在Formalin 誘導(dǎo)的頭面部炎癥自發(fā)痛中的作用，為三叉神經(jīng)痛的發(fā)病機(jī)制和藥物治療奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 實驗動物

實驗動物的使用和相關(guān)實驗獲得江漢大學(xué)醫(yī)學(xué)倫理學(xué)委員會批準(zhǔn)。成年SD 雌性大鼠40 只，體重250～300 g，常規(guī)條件下飼養(yǎng)，自然晝夜；自由飲水、取食。大鼠在檢測之前的5 d 每天對周圍的實驗室環(huán)境以及檢測的盒子適應(yīng)至少30 min。實驗操作都在室溫（20 ± 1）℃下進(jìn)行。動物購自湖北省實驗動物研究中心，動物飼養(yǎng)合格證號：00012239。

1.2 5% Formalin 溶液的配制

取37%Formalin 0.5 mL，加入生理鹽水9.5 mL。

1.3 炎癥痛模型的制備與行為學(xué)觀察

本實驗嚴(yán)格按照國際疼痛學(xué)會（AISP）關(guān)于使用動物進(jìn)行疼痛實驗研究綱要的要求實施和完成。藥物注射前，將大鼠提前30 min 置于觀察箱中去適應(yīng)實驗環(huán)境。大鼠上唇皮下注射致炎劑5%的福爾馬林50 μL 造成無菌性炎癥，注射的大致部位見圖1。對照組動物則注射等量溶劑。注射后，立即把動物放在觀察箱中，以動物抓搔注射部位的時間（s）為痛敏行為觀察指標(biāo)，觀察記錄45 min，共分成15 節(jié)，以每節(jié)3 min 為一觀察評分時段，每節(jié)疼痛程度按計時（s）評分。

圖1 藥物在面部的大致注射區(qū)域

1.4 實驗分組

將實驗動物隨機(jī)分為5 組：正常對照組、炎癥痛模型組、10 μg、30 μg 和100 μg Amiloride（Calbiochem 公司產(chǎn)品）組，8 只/ 組，每只大鼠僅被使用一次，實驗結(jié)束后以過量的麻醉藥處死。對照組：右側(cè)上唇皮下注射生理鹽水（50 μL）前5 min，該部位注射50 μL 溶劑。炎性痛模型組：右側(cè)上唇皮下注射Formalin（50 μL）前5 min，該部位注射50 μL 溶劑。Amiloride 組：在Formalin注射前5 min，右側(cè)上唇皮下注射相應(yīng)劑量的Amiloride 50 μL。

1.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計

所有數(shù)據(jù)以Mean ± Ssem表示。不同組間比較采用方差分析，兩組間比較采用t 檢驗。P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 頜面部2.5% Formalin 皮下注射可誘發(fā)典型的傷害性感受反應(yīng)

生理鹽水對照組偶有個別的擦面行為（自然的生理行為）。5% Formalin 注射后動物有明顯的自發(fā)痛行為反應(yīng)，注射后即刻出現(xiàn)快速的用前（或后）爪抓擦頜面注射區(qū)的疼痛行為反應(yīng)，持續(xù)約0 ～3 min，3 ～12 min 相對平靜，12 ～36 min 時間段又出現(xiàn)明顯而且集中的抓擦行為反應(yīng)，36 ～45 min 僅可見少量的抓擦行為反應(yīng)。在0 ～3 min和12 ～36 min 各觀察時間段，生理鹽水對照組和Formalin 炎性疼痛組洗面的持續(xù)時間差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P ＜0. 05，圖2）。除抓擦注射部位外，F(xiàn)ormalin 炎性疼痛組動物在注射Formalin 溶液的前3 min 內(nèi)還有跳躍、尖叫、軀體震顫等其他傷害性行為反應(yīng)。

2.2 Amiloride 對Formalin 誘導(dǎo)的自發(fā)痛的有抑制作用

圖2 對照組、福爾馬林炎癥痛模型組搔抓活動的時程圖

在注射福爾馬林5 min 前，大鼠上唇皮下注射不同劑量的Amiloride，發(fā)現(xiàn)Amiloride 對Formalin 誘導(dǎo)的第二相傷害性反應(yīng)的抑制作用有劑量依賴性。如圖3 所示，與Formalin 組相比，10 μg Amiloride 組沒有明顯的縮短面部炎性疼痛大鼠各時相洗面的持續(xù)時間（P ＞0. 05）；30 μg Amiloride 組可明顯減少大鼠福爾馬林誘導(dǎo)的第二相（12 ～21 min）的洗面的持續(xù)時間（P ＜0. 05），對第一相洗面的持續(xù)時間無明顯影響；100 μg Amiloride 對福爾馬林誘導(dǎo)的第二相的洗面的持續(xù)時間的抑制作用可延長到12 ～27 min（P ＜0. 05）。在Formalin 注射后的15 ～18 min 這個時間段，福爾馬林對照組動物洗面的持續(xù)時間為（57. 8 ± 10. 6）s，而30 μg Amiloride 預(yù)先處理組動物洗面的持續(xù)時間為（27. 7 ± 5. 8）s，100 μg Amiloride 預(yù)先處理組動物洗面的持續(xù)時間為（22.3±6.3）s。

圖3 福爾馬林炎癥痛模型組和皮下注射不同劑量的阿米洛利（10 μg、30 μg 和100 μg）組搔抓活動的時程圖

3 討論

福爾馬林實驗是最先由Dubuisson 和Dennis于1977 年引入疼痛研究的動物模型，對貓、鼠后爪皮下注射稀釋的福爾馬林可誘導(dǎo)傷害性自發(fā)疼痛，動物對福爾馬林刺激產(chǎn)生的行為反應(yīng)，典型的時間過程為2 個時相［4］。1989 年Clavelou 等［5］將福爾馬林實驗應(yīng)用于頜面部疼痛的動物實驗中，并認(rèn)為抓擦（rubbing or grooming）注射部位皮膚是一可靠的、具有可比性的傷害性行為，這一行為持續(xù)時間的長短可作為評價三叉神經(jīng)系統(tǒng)受傷害性刺激后產(chǎn)生疼痛的強(qiáng)度的可靠方法［6］。在本研究中，F(xiàn)ormalin 炎性疼痛組的傷害性行為反應(yīng)也呈典型的2 個時相，說明頜面部注射福爾馬林后，產(chǎn)生的疼痛行為反應(yīng)是一種穩(wěn)定的，可重復(fù)的傷害性行為，故可應(yīng)用于頜面部疼痛的研究。

在外周，ASICs 已被廣泛認(rèn)為是一種傷害性感覺的受體，它直接參與了組織酸化所誘導(dǎo)的痛覺。初級感覺神經(jīng)元可以通過ASICs 來感受外周的組織酸化，酸誘發(fā)的經(jīng)ASICs 介導(dǎo)的電流（Iacid）能使初級感覺神經(jīng)元去極化甚至產(chǎn)生一連串的動作電位，從而導(dǎo)致疼痛的產(chǎn)生。福爾馬林實驗兩期傷害性行為變化分別涉及不同的致痛機(jī)理［7］。實驗表明P 物質(zhì)和緩激肽參與第一期反應(yīng)，而在第二期則有組織胺、5－羥色胺、前列腺素和緩激肽的參與［8］。本實驗結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在注射Formalin之前，皮下之前注射ASICs 的拮抗劑Amiloride 可劑量依賴性地抑制Formalin 誘致的持續(xù)性自發(fā)痛的第二相的反應(yīng)，說明ASICs 參與Formalin 誘致的面部炎性自發(fā)痛二期的產(chǎn)生。目前研究發(fā)現(xiàn)在TG 上至少有ASIC1b 和ASIC3 的表達(dá)［9］，在Formalin 誘導(dǎo)的面部炎性疼痛模型中，到底是ASIC1b或者是ASIC3 或兩組均參與Formalin 誘導(dǎo)的炎性疼痛還有待于進(jìn)一步的研究證實。

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