王洪家，郭福慶

(1.天津市北辰區(qū)藥品檢驗(yàn)所，天津 300400; 2.天津市藥品檢驗(yàn)所，天津 300070)

妥布霉素為氨基糖苷類(lèi)抗生素，妥布霉素地塞米松眼膏在國(guó)家藥品標(biāo)準(zhǔn)中采用高效液相法測(cè)定其含量，本試驗(yàn)采用比濁法測(cè)定其效價(jià)，具有操作簡(jiǎn)便、結(jié)果精確、培養(yǎng)時(shí)間短等特點(diǎn)，可用于該制劑的質(zhì)量控制。

1 儀器與試驗(yàn)材料

1.1 儀器 WBS -100 型微生物比濁法測(cè)定儀(北京先驅(qū)威峰技術(shù)開(kāi)發(fā)公司)。

1.2 培養(yǎng)基 抗生素檢定培養(yǎng)基Ⅲ號(hào)，pH 值7.0 ～7.2(北京奧博星生物技術(shù)有限公司，批號(hào)20080318);抗生素檢定培養(yǎng)基Ⅰ號(hào)，pH 值7.8 ～8.0(青島高科園海博生物技術(shù)有限公司，批號(hào)20060615);營(yíng)養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基(北京三藥科技開(kāi)發(fā)公司，批號(hào)080710)。

1.3 標(biāo)準(zhǔn)品 妥布霉素標(biāo)準(zhǔn)品(由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，批號(hào)0340 -200002，效價(jià):880 U/mg)，地塞米松對(duì)照品(由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供，批號(hào)100129 -200804)。

1.4 試驗(yàn)菌 金黃色葡萄球菌［CMCC(B)26003］由中國(guó)藥品生物制品檢定所提供。

1.5 樣品 妥布霉素地塞米松眼膏(由齊魯制藥有限公司提供，批號(hào)004007PF、207030TF、202009PF)。

2 方法與結(jié)果

2.1 試驗(yàn)用菌懸液的制備 取金黃色葡萄球菌接種于營(yíng)養(yǎng)瓊脂斜面培養(yǎng)基上，于37 ℃培養(yǎng)20 h，加滅菌生理鹽水5 ml，將菌苔洗下制成菌懸液。

2.2 含試驗(yàn)菌培養(yǎng)基的制備 取試驗(yàn)用菌懸液約2 ml，加至400 ml 抗生素檢定培養(yǎng)基Ⅲ號(hào)中，搖勻(此培養(yǎng)基培養(yǎng)3 ～4 h 吸光度在0.3 ～0.7 之間，劑距為1.5或2 的相鄰劑量間的吸光度差值不少于0.1)。

2.3 標(biāo)準(zhǔn)品溶液的制備 精密稱(chēng)取妥布霉素標(biāo)準(zhǔn)品28.45 mg，置25 ml 量瓶中，加滅菌水稀釋至刻度，搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)品儲(chǔ)備液(1000 U/ml)。精密量取溶液5 ml，置50 ml 量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻;再精密量取溶液5 ml，置50 ml 量瓶中，加pH 7.8 滅菌磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)品溶液(10 U/ml)。

2.4 線(xiàn)性范圍［1］取上述標(biāo)準(zhǔn)品溶液(10 U/ml)，用pH 7.8 滅菌磷酸鹽緩沖液，分別定量稀釋制成每1 ml中含0.4、0.5、0.6、0.8 和1.0 U 的溶液，分別精密量取1.0 ml 于比色管中(每一濃度平行4 管，按拉丁方排列)，在各比色管中精密加入含試驗(yàn)菌培養(yǎng)基9.0 ml，立即混勻，置比濁法測(cè)定儀中，37 ℃培養(yǎng)，于530 nm 在線(xiàn)測(cè)定各管吸光度，培養(yǎng)時(shí)間約為4 h。同時(shí)另取1 支比色管加入pH 7.8 滅菌磷酸鹽緩沖液1.0 ml，精密加入含試驗(yàn)菌培養(yǎng)基9.0 ml，立即混勻，同法操作，作為細(xì)菌生長(zhǎng)情況的陽(yáng)性對(duì)照。

以濃度的對(duì)數(shù)值為橫坐標(biāo)，以吸光度平均值為縱坐標(biāo)，進(jìn)行線(xiàn)性回歸，得回歸方程:A = -0.95 log C +0.2758(r=0.9956)。結(jié)果表明，在0.4 ～1.0 U/ml 范圍內(nèi)濃度的對(duì)數(shù)值與吸光度呈良好的線(xiàn)性關(guān)系。

2.5 精密度試驗(yàn) 取批號(hào)為004007PF 的樣品重復(fù)測(cè)定5 次，結(jié)果分別為100.4%、100.0%、99.2%、99.5%和98.9%，平均值為99.6%，RSD 為0.6%(n=5)。

2.6 回收率試驗(yàn)

2.6.1 供試品溶液制備 精密稱(chēng)取妥布霉素標(biāo)準(zhǔn)品23.68、29.27 和35.46 mg 共3 份，置25 ml 量瓶中，加水稀釋至刻度，精密量取1 ml，加入含有廠家處方量輔料的50 ml 乙醚中，用水振搖提取5 次，每次15 ml，合并提取液至100 ml 量瓶中，作為供試品溶液(約為8、10 和12 U/ml)。

2.6.2 標(biāo)準(zhǔn)品溶液制備 精密稱(chēng)取妥布霉素標(biāo)準(zhǔn)品23.83、30.03 和35.24 mg，分別置25 ml 量瓶中，加水溶解并稀釋至刻度，搖勻。精密量取上述溶液5 ml，置50 ml 量瓶中，再精密量取5 ml，置50 ml 量瓶中，加水稀釋至刻度，搖勻，作為標(biāo)準(zhǔn)品溶液(約為8、10 和12 U/ml)。

2.6.3 回收率測(cè)定 取標(biāo)準(zhǔn)品溶液(約為8、10 和12 U/ml)和供試品溶液(約為8、10 和12 U/ml)，分別用滅菌pH 7.8 磷酸鹽緩沖液制成劑間比為1.5 的高低劑量的溶液(濃度應(yīng)在線(xiàn)性范圍)，照妥布霉素“線(xiàn)性范圍”項(xiàng)下方法測(cè)定，結(jié)果平均回收率為99.7%，RSD為0.9%，見(jiàn)表1。

2.7 專(zhuān)屬性考查 稱(chēng)取妥布霉素地塞米松眼膏的輔料，按處方量配比制成不含妥布霉素的樣品，按照“2.6.1”項(xiàng)下的方法制備陽(yáng)性對(duì)照溶液。同時(shí)以1 ml pH 7.8 磷酸鹽緩沖液代替被測(cè)供試液作為空白溶液。取上述兩種溶液照妥布霉素“2.4”項(xiàng)下方法測(cè)定，結(jié)果空白對(duì)照液與陽(yáng)性對(duì)照液吸光度比值分別為99.7%、100.1%、99.6%和99.5%，表明輔料對(duì)妥布霉素測(cè)定無(wú)干擾。

表1 回收率試驗(yàn)結(jié)果

3 樣品測(cè)定

精密稱(chēng)取妥布霉素地塞米松眼膏約0.33 g，置100 ml 錐形瓶中，加入乙醚50 ml，超聲使溶解，用水振搖提取5 次，每次15 ml，合并提取液至100 ml 量瓶中，搖勻，作為供試品儲(chǔ)備液(10 U/ml)。分別精密量取供試品溶液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液7.5 ml 和5.0 ml，置100 ml 量瓶中，用滅菌pH 7.8 磷酸鹽緩沖液稀釋至刻度，制成每1 ml 含0.75 U 和0.5 U 的高低劑量的溶液(劑距比為1.5∶ 1)，照妥布霉素“2.4”項(xiàng)下方法測(cè)定，并與管碟法、HPLC 法測(cè)定結(jié)果比較，結(jié)果表明，三種方法的測(cè)定結(jié)果基本一致，結(jié)果見(jiàn)表2。

表2 比濁法與管碟法和HPLC 法測(cè)量結(jié)果比較

4 討論

4.1 因抗生素類(lèi)成分復(fù)雜，不易提純，故比濁法較高效液相法更能客觀地反映藥品內(nèi)在質(zhì)量。

4.2 試驗(yàn)用菌種應(yīng)保持新鮮、純凈，新制備的菌種斜面和菌懸液應(yīng)在1 周內(nèi)使用。如果染有雜菌，則可導(dǎo)致各比色管吸光度高低不一，可信限率高;如果菌種不新鮮，活力差，則可導(dǎo)致各比色管吸光度值極低或造成細(xì)菌停止生長(zhǎng)。

4.3 溶液稀釋用移液管應(yīng)干凈，避免因稀釋造成的誤差;比色管加入含試驗(yàn)菌培養(yǎng)基后，比色管壁上不得存有氣泡，否則影響測(cè)量結(jié)果的準(zhǔn)確性。

1 郭福慶，王洪家.微生物比濁法測(cè)定妥布霉素、硫酸妥布霉素注射液及妥布霉素滴眼液的效價(jià)［J］.天津藥學(xué)，2010，22(6):4