趙 銘 劉 冰 王 臻，2 李邦印▲ 張靈霞

1.解放軍第三〇九醫(yī)院，北京 100091；2.江西農(nóng)業(yè)大學，江西南昌 330045

最初是由Jongstra等發(fā)現(xiàn)的一種短肽，稱為519，1997年Pena等把這種短肽命名為顆粒裂解肽（NKG5）[1-2]；NKG5是一種細胞毒性效應蛋白，屬于SAPLIP（saposin like protein）家族成員，它能夠選擇性地在NK細胞和激活后的T淋巴細胞中表達，其天然肽和重組肽都具有廣譜抗菌活性，對G+和G-細菌、真菌、寄生蟲均有殺菌活力，如鼠傷寒沙門菌、單核李司特菌、大腸埃希菌、金黃色葡萄球菌，真菌有新型隱球菌、白念珠菌，寄生蟲有利什曼蟲，尤其是對分枝桿菌有直接的細胞毒性[1]，它與穿孔素和粒酶在溶淋巴顆粒上有協(xié)同作用[3]。

引起筆者注意的是NKG5在體外不僅表現(xiàn)為對結(jié)核分枝桿菌很強的殺傷作用，且協(xié)同穿孔素對細胞內(nèi)的結(jié)核桿菌也有很強的殺傷能力[3-5]。文獻報道，顆粒裂解肽在72 h內(nèi)可以殺滅90%的哺乳動物結(jié)核菌素（MTB），其殺滅作用呈劑量依賴性[6]。

眾所周知，對結(jié)核桿菌有效的藥物最早是30年前發(fā)現(xiàn)的，更為嚴重的是結(jié)核桿菌對為數(shù)很少的治療藥物均已產(chǎn)生了不同程度的耐藥性。全球亟需對付結(jié)核桿菌的有效措施，包括預防性和治療性疫苗與新型藥物，而NKG5有可能成為抗結(jié)核病的一種新型生物制劑。因此，筆者所在課題組開展了一系列針對NKG5的研究。本論文根據(jù)從Genebank中報道的NKG5基因序列，設計把NKG5的部分氨基酸編碼Cys69、96、107、132、138位變?yōu)镾er，采用寡核苷酸合成方式，通過分子生物學技術(shù)拼接成為NKG5-Ser編碼序列，然后在原核細胞中融合表達，擬為進一步對比研究顆粒裂解肽殺滅結(jié)核菌的功能提供基礎。

1 材料與方法

1.1 材料

PCR產(chǎn)物純化試劑盒購于Qiagen，限制性內(nèi)切酶XhoⅠ和BamHⅠ、T4 DNA連接酶購自NEB，2×pfu、Master Mix、DNA mole wheight marker、羊抗小鼠GST單抗和HRP標記的羊IgG購自天根生物技術(shù)（北京）有限公司，發(fā)光試劑盒購、GST純化樹脂和還原型谷胱甘肽購自威格拉斯生物技術(shù)（北京）有限公司，Red Taq購自賽百盛生物技術(shù)有限公司；pGEX-4T-1、大腸埃希菌BL21（DE3）pLysS、DH5α由解放軍第三〇九醫(yī)院結(jié)核病研究所分子生物學實驗室保存。

1.2 方法

1.2.1 引物設計 搜索Gene bank中hNKG5的cDNA序列（登錄號：NM 006433），設計合成氨基酸編碼全序列并設計一對引物，其序列如下（下劃線部分為BamHⅠ和XhoⅠ酶切位點）上游引物5′-CTACTAGCTAGCGGATCCGGCCGTGACTACCGCACC-3′，下游引物5′-CATCGCTCG AGCTCATTATGGACCTGTAGAAGGGATACTCAAACGGAGGTCCTCG C-3′。

1.2.2 顆粒裂解肽氨基酸編碼序列的克隆及序列測定 采用合成的寡核苷酸序列，拼接成NKG5-Ser目的基因，將純化的目的片段連接到克隆載體pGEMT中，轉(zhuǎn)化入處于感受態(tài)的大腸埃希菌DH5α，涂布于含有相應抗生素的LB瓊脂培養(yǎng)基上，以藍白斑篩選方法初步篩選陽性克隆，挑取準陽性的單個白色菌落，提取質(zhì)粒，進行PCR鑒定，并且對陽性重組子進一步提取質(zhì)粒后進行雙酶切確定其重組片段的大小，最后選擇重組質(zhì)粒（pGEMT-NKG5-Se）在ABI PRISMTM 3700型DNA自動測序儀上測序（由上海生工生物工程技術(shù)服務有限公司生產(chǎn)）。

1.2.3 原核表達載體的構(gòu)建及其表達 用BamHⅠ、XhoⅠ雙酶切重組質(zhì)粒pGEMT-NKG5-Ser，回收目的基因，將其進一步克隆到被同樣雙酶切的原核表達載體pGEX-4T-1中，構(gòu)建重組的原核表達載體（pGEX-4T-1-NKG5-Ser），轉(zhuǎn)化大腸埃希菌，用PCR方法及雙酶切瓊脂糖電泳圖進行鑒定。

1.2.4 融合蛋白的表達及條件優(yōu)化 用滅菌牙簽挑取重組菌落BL21（DE3）pLysS，接種于含氨芐青霉素的LB培養(yǎng)基中，培養(yǎng)過夜，取培養(yǎng)物按1∶50比例轉(zhuǎn)種于新鮮含氨卞西林的LB培養(yǎng)液中，37℃震蕩培養(yǎng)至OD600值為0.6～0.8，加入IPTG至終濃度1mmol/L誘導表達。繼續(xù)培養(yǎng)，分不同時間，分批取1 mL誘導培養(yǎng)物，離心集菌體沉淀，用100μL 2×SDS樣品緩沖液重懸沉淀，然后100℃水浴5 min，12 000 r/min離心10 min，取10μL進行12% SDS-PAGE，觀察表達量，其結(jié)果是獲得優(yōu)化對IPTG誘導時間。

1.2.5 蛋白純化 接種pGEX-4T-1-NKG5-Ser/BL21菌，37℃、200 r/min振搖過夜，以1∶50比例接種于500 mL的LB培養(yǎng)基，37℃、200 r/min振搖4 h后，加入IPTG至終濃度1mmol/L，28℃、200 r/min繼續(xù)培養(yǎng)4 h，收集菌液，用預冷的PBS溶液重懸菌體沉淀，進行超聲破菌后，加入TritonX-100至終濃度為1%，高速離心取上清。上清加入預裝有還原型谷胱甘肽親和層析柱，5倍柱床體積的PBS，最后用含有還原性谷胱甘肽的洗脫液洗出GST-NKG5-Ser，對洗脫蛋白進行SDS-PAGE分析。

1.2.6 免疫印跡（Western blot）分析 純化后的融合蛋白進行SDS-PAGE后，電轉(zhuǎn)移于硝酸纖維素（NC）膜上（半干狀態(tài)可以密封低溫保存），用雙蒸水漂洗NC膜；加入封閉液（含5%脫脂奶粉和0.05%Tween20的pH7.5的TBS），37℃孵育1 h；用TBS在37℃洗膜3次，每次10 min，然后依次加鼠GST單克隆抗體（37℃1 h，洗膜同前）和HRPO標記的羊抗鼠二抗（37℃1 h，洗膜4次，每次15 min），雙蒸水沖洗，終止反應，取出，按照試劑盒操作步驟進行化學發(fā)光檢測，壓片，洗片，觀察印跡結(jié)果。

2 結(jié)果

2.1 PCR擴增獲得目的基因

利用合成寡核苷酸的方法拼接得目的基因，大小約為240 bp的顆粒裂解肽片段（圖1）。

2.2 重組質(zhì)粒pGEM-T-NKG5-Ser的鑒定

目的基因克隆到載體pGEMT中，重組子質(zhì)粒經(jīng)雙酶切及PCR鑒定均可以得260 bp大小的片段（圖2）。連接了重組質(zhì)粒由上海生物工程公司進行DNA序列測定。測序結(jié)果表明，所克隆的DNA片段所編碼的氨基酸序，與預期的氨基酸序列一致，成功地將半胱氨酸定位突變?yōu)镾er。與突變子氨基酸序列相應的NKG5氨基酸部分為：GRDYRTCLTIVQKLKKMVDKPTQRSVSNAATRVCRTGRSR WRDVCRNFMRRYQSRVIQGLVAGETAQQICEDLRLCIPST GPL。

圖2 pGEMT-NKG5-SerER鑒定

2.3 表達載體的構(gòu)建

將雙酶切重組質(zhì)粒r獲得的DNA片段，亞克隆到同樣雙酶切的原核表達載體pGEX-4T-1r中，構(gòu)建重組原核表達載體pGEX-4T-1-NKG5-Ser，重組子質(zhì)粒進行PCR鑒定及雙酶切鑒定其瓊脂糖電泳圖分別見于圖3a和見圖3b。

2.4 原核表達及條件優(yōu)化[6]

將重組菌接種于LB＋1%甘油培養(yǎng)液，分別采用24、28、32、37℃進行連續(xù)培養(yǎng)誘導，37℃培養(yǎng)28℃誘導及37℃培養(yǎng)32℃誘導，1、2、3、4、5、6、7 h誘導；結(jié)果表明：溫度和誘導時間對蛋白表達量有顯著影響（圖4、5）。

2.5 蛋白純化

對所表達的蛋白進行純化后，得到純度達95%以上的重組蛋白，通過SDS-PAGE分析，發(fā)現(xiàn)得到一條分子量約為35 kD的融合蛋白條帶（圖6）。

2.6 Western Blot印跡分析

為證實NKG5-Ser基因得到表達，采用Western Blot雜交技術(shù)對原核重組表達產(chǎn)物進行了鑒定，結(jié)果顯示分子量約為29 kD的蛋白條帶能特異性地與鼠抗GST單克隆抗體反應（此為GST反應），在分子量約為35 kD的位置出現(xiàn)一條特異性反應帶（應該為GST-Ser融合蛋白）（圖7）；進一步證實該重組蛋白的分子量大小正確。

3 討論

NKG5是一種低分子量多肽，體外實驗表明具有抗微生物功能及殺傷腫瘤細胞的作用，其分子機制可能是通過神經(jīng)酰氨、caspase依賴/非依賴途徑等來實現(xiàn)其功能的，而且它的殺傷功能與其自身二級結(jié)構(gòu)變化及所攜帶正電荷氨基酸含量亦相關[7]。有文獻已經(jīng)展開了重組NKG5實驗研究，且體外實驗表明重組的9 kD NKG5多肽可以殺傷細菌、真菌、原蟲（比如革蘭陰性或陽性細菌、大型利什曼原蟲、新型的隱球菌）等[6-8]。

筆者在以往的實驗基礎上，發(fā)現(xiàn)NKG5在大腸埃希菌中表達的過程中可能由于二硫鍵太多，多表達為包涵體，且影響分子的復性，其可能會影響以后的生物活性實驗。因此在本試驗中，筆者合成了全序列編碼的寡核苷酸片段，將某些位點突變?yōu)閟er，擬進行可溶性表達探索。實驗中通過SDS-PAGE和免疫印跡分析發(fā)現(xiàn)在分子量約35 kD處可見一條特異性條帶，證明NKG5融合蛋白得到表達，但表達量不夠理想。

影響原核表達系統(tǒng)重組蛋白表達效率的因素很多，除了載體系統(tǒng)之外，可能還由外源基因本身的特性決定。顆粒裂解肽是具有廣譜的抗病原微生物及殺傷腫瘤細胞的陽離子抗菌肽[9]。有學者等對顆粒裂解肽的晶體結(jié)構(gòu)研究發(fā)現(xiàn)，顆粒裂解肽含有5個α-螺旋（H1-H5）結(jié)構(gòu)，較多的正電荷與穩(wěn)定的兩性α-螺旋相結(jié)合有助于提高殺菌活性[10-11]。某些結(jié)構(gòu)域可能造成大腸桿菌部分細胞的破裂[12-13]，推測其機制可能是從細胞內(nèi)部作用于內(nèi)膜和外膜。而破裂細胞中的少量外源蛋白可能大多被蛋白酶降解，未被降解的微量外源蛋白作用于其他細胞的外膜[14]。另一方面，外源蛋白還可能抑制DNA的復制和轉(zhuǎn)錄[11]，進而抑制細胞的生長和代謝。因此，可能是重組肽的結(jié)構(gòu)本身直接或者間接影響了工程菌的表達活性。

綜合上述，筆者獲得了重組蛋白的生物工程菌，足以為進一步實驗提供產(chǎn)品。實驗中提出了其重組蛋白在原核系統(tǒng)表達量偏低的問題，若提高NKG5-ser表達量，使之高效表達為可溶性的活性肽，可能還需要使用其他載體系統(tǒng)，或者在人源性或動物源性永生化細胞系中進行體外真核細胞表達的研究，這值得進一步探索。

[1]Alan M，Krensky Granulysin.A Novel Antibacterial Peptide of Cytolytic T Lymphocytes and Natural Killer Cells[J].Biochemical Pharmacology，2000，59：317-320.

[2]Jongstra J，Schall TJ，Dyer BJ，et al.The isolation and sequence of a novel gene from a human functional T cell line[J].J Exp Med，1987，165（3）：601.

[3]Pena SV，Krensky AM，Granulysin.A new human cytolytic granuleassociated protein with possible involvementin cell-mediated cytotoxicity[J].Semin Immunol，1997，9（2）：117.

[4]謝建平，王洪海.結(jié)核桿菌的克星——顆粒裂解肽[J].中國藥學雜志，2001，36（4）：225-226.

[5]SHE Kaufmann.Protection against tuberculosis：cytokines，T cells，and macrophages[J].ARD BM Journal，2005，10（1）：54-58.

[6]Steffen S，Dennis AH，Rachel T，et al.An antimicrobial activity of cytolytic T cells mediated by granulysin[J].Science，1998，282（5386）：121.

[7]Gamen S，Hanson DA，Kaspar A，et al.Granulysin induced apoptosis I.Involvement of at least two distinct pathways[J].J Immunol，1998，161（4）：1758-1764.

[8]Stenger S，Rosat JP，Bloom BR，et al.Granulysin：a lethal weapon of cytolytic T cells[J].Immunol Today，1999，20（8）：390.

[9]Huang LP，Lyu SC，Clayberqer C，et al.Granulysin-mediated tumer rejection in transgenic mice[J].J Immunol，2007，178（1）：77-84.

[10]Anderson DH，Sawaya MR，Cascio D，et al.Granulysin crystal structure and a structure-derived lytic mechanism[J].J Mol Biol，2003，325（2）：355-365.

[11]查向東，徐康森，劉兢.陽離子抗菌肽研究進展[J].中國藥理學通報，2003，19（7）：735-740.

[12]楊金環(huán)，查向東，方紅，等.顆粒裂解肽G13結(jié)構(gòu)域的表達及其對大腸桿菌活力的影響[J].中國生物制品學雜志，2008，21（6）：467-470.

[13]梁琳，張萍萍，劉兢，等.顆粒裂解肽G13結(jié)構(gòu)域引發(fā)細菌SOS反應[J].中國抗生素雜志，2011，36（5）：380-384.

[14]Park Y，Hahm KS.Antimicrobial peptides（AMPs）：peptide structure and mode of action[J].J Biochem Mol Biol，2005，38（6）：507-516.