邵 楓 白雪源 陳香美

解放軍總醫(yī)院腎病科 腎臟疾病國家重點實驗室，北京 100853

Toll受體（Toll-like receptors，TLRs）是天然免疫系統(tǒng)的受體之一，在啟動和調(diào)節(jié)天然免疫應(yīng)答及誘導(dǎo)獲得性免疫中發(fā)揮重要作用。在哺乳動物中已發(fā)現(xiàn)11種TLRs成員。TLRs是一種特定的模式識別受體（pattern cognition receptors，PRRs），能識別細菌等病原體的相關(guān)分子結(jié)構(gòu)如脂多糖與脂蛋白等分子，然后激活其下游信號通路分子髓樣分化因子MyD88（myeloid differentiation factor 88）[1]。MyD88是TLRs信號通路重要的信號適配器，當(dāng)被活化后可進一步激活I(lǐng)KK-NF-κB信號通路或JNK-NF-κB信號通路，促進免疫炎性因子的表達[2-3]。TLR3則通過激活MyD88非依賴性信號通路促進炎癥分子的表達。

雖然已經(jīng)提出多種衰老學(xué)說如氧化應(yīng)激（oxidative stress）等，但是目前衰老的機制還不是很清楚[4-5]，近年研究表明免疫炎癥可能與衰老的發(fā)生有關(guān)[6]。腎臟是人體內(nèi)能量代謝非?；钴S的器官，因此腎臟易于發(fā)生衰老，老年人腎臟功能隨年齡的增加逐漸降低[7]，但是腎臟器官衰老的機制并不清楚。TLRs系統(tǒng)和腎臟衰老的關(guān)系目前尚不清楚。

本研究擬通過研究TLRs及其下游MyD88信號通路分子炎癥因子在3、12、24月齡Fischer 344（F344）大鼠腎臟組織中的表達變化以探討TLRs在腎臟衰老中的作用及其機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與標本處理

2月齡清潔級近交系雄性F344大鼠（體重180～190 g）購自北京市維通利華實驗動物中心。實驗動物分3月齡組（青年組），12月齡組（中年組）和24月齡組（老年組），每組各20只。每籠4只，飼養(yǎng)于溫度（22±1）℃、濕度40%環(huán)境中，自由飲食，12 h光照周期。待各組大鼠分別飼養(yǎng)至3、12、24個月后稱量體重，用戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔麻醉，留取血樣，然后分別取出腎臟經(jīng)冰生理鹽水灌洗除去殘留血跡，稱取腎重。腎上極的腎組織投入10%的中性福爾馬林中固定，用于免疫組化和腎臟病理。腎下極快速投入OCT復(fù)合物中，用于免疫熒光染色。剩余的腎組織切除小塊投入液氮中，用于Western blot和qRT-PCR分析。

1.2 生化檢測

取血后3000 r/min離心10 min，收集血清，檢測血尿素氮（BUN）、血肌酐（SCR）、血糖（GLU）、三酰甘油（TG）及膽固醇（CHOL）。用比色法檢測BUN和TG；酶法檢測SCR和CHOL；己糖激酶法檢測GLU。取尿液測定尿蛋白/肌酐比值，鄰苯三酚紅鉬法測定尿蛋白，肌氨酸氧化酶法測定尿肌酐。

1.3 Western blot分析

用預(yù)冷的RIPA裂解液（含50mmol/L Tris pH 7.5，150mmol/L NaCl，1% NP-40，0.1%十二烷基磺酸鈉（SDS），10mmol/L乙二胺四乙酸（EDTA），1mmol/L苯甲基磺酰氟（PMSF）及蛋白酶抑制劑（2 mg/L aprotinin，2 mg/L leupeptin）提取腎組織總蛋白，進行蛋白濃度測定和變性蛋白。取上樣量80～100μg，轉(zhuǎn)膜后用Western blot檢測各指標變化。用5%牛血清蛋白（BSA）室溫封閉1 h，一抗TLR4、TLR6、TLR8、TLR10和TLR11（1∶200稀釋）；TLR9（1∶250稀釋）；TLR1、TLR3、TLR5、NF-κB p65和phospho-NF-κB p65（1∶500稀釋）；TLR2、TLR7和IK-Bα（1∶1000稀釋），4℃過夜。二抗分別加辣根過氧化物酶標記的抗羊、抗兔或抗鼠IgG（1∶1000稀釋），室溫孵育1 h，ECL顯影。結(jié)果以β-Actin的蛋白表達為內(nèi)參照，用AlphalmagerTM 2200凝膠圖象分析系統(tǒng)，進行半定量分析。

1.4 RNA提取和逆轉(zhuǎn)錄

Trizol法提取腎臟組織RNA，按1 mL/100 mg組織在研磨 器 中 加 入Trizol試 劑（Invitrogen，Carlsbad，CA，USA）。RNA用紫外分光光度計測定濃度。用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（北京，全式金生物技術(shù)有限公司）將RNA反轉(zhuǎn)錄為cDNA模板。

1.5 實時定量聚合酶鏈反應(yīng)（qRT-PCR）

用Takara公司DRR081A系統(tǒng)檢測甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH），白介素-12b（IL-12b），IL-6，趨化因子配體3（CCL3），CCL4，CCL5，細胞間黏附分子-1（intercellular adhesion molecule，ICAM-1），CD80和腫瘤壞死因子-α（tumor necrosis factor-α，TNF-α）mRNA的表達。GAPDH為內(nèi)參照。各基因引物序列見表1。反應(yīng)體系20μL，包括：50 ng cDNA，0.4μmol/L引物和10μL 2×SYBR green buffer。每個樣本重復(fù)3次。反應(yīng)條件為94℃5 s、60℃30 s和72℃30 s，共40個循環(huán)。

數(shù)據(jù)分析采用CT值法[8]，ΔCT=CT（靶基因）-CT（內(nèi)參基因）。ΔCT值越高，表示表達量越低。△△CT=（CT靶基因-CT內(nèi)參基因）實驗組-（CT靶基因-CT內(nèi)參基因）對照組。本實驗對照組為3月齡組大鼠，實驗組為12月齡組和24月齡組大鼠。相對于3月齡組大鼠，12月齡組和24月齡組大鼠改變的倍數(shù)（fold change）=2-ΔΔCT。

表1 qRT-PCR引物序列和產(chǎn)物長度

1.6 統(tǒng)計學(xué)方法

采用統(tǒng)計軟件SPSS 17.0對數(shù)據(jù)進行分析，正態(tài)分布的計量資料以均數(shù)±標準差表示，多組間比較采用方差分析，兩兩比較采用LSD-t檢驗。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 大鼠腎臟功能變化

12月齡組和24月齡組體重、腎重和尿蛋白/肌酐比值高于3月齡組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；24月齡組大鼠血BUN水平高于3月齡組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；而血SCR、GLU和CHOL水平三組差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）。24月齡組腎重和尿蛋白/肌酐比值高于12月齡組差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見表2。

表2 大鼠腎臟功能和代謝功能變化（±s）

表2 大鼠腎臟功能和代謝功能變化（±s）

注：與3月齡組比較，*P＜0.05；24月齡組與12月齡組比較，#P＜0.05。BUN：尿素氮；SCR：血肌酐；GLU：血糖；TG：三酰甘油；CHOL：膽固醇

組別 體重（g）腎重（g）血BUN（mmol/L）血SCR（mmol/L）GLU（mmol/L）TG（mmol/L）CHOL（mmol/L）尿蛋白/肌酐（mg/mmoL）3月齡組12月齡組24月齡組236.3±12.28 466.86±32.62*617.8±57.34*1.67±0.68 3.25±0.50*5.01±1.00*#5.73±0.47 6.51±0.40 6.86±1.10*27.15±2.60 25.62±1.94 25.8±2.04 7.09±1.02 5.745±0.29 6.09±1.31 1.20±0.32 2.32±0.46*3.22±0.82*1.55±0.16 2.73±0.28 3.11±0.36 146.01±22.72 164.81±38.31*256.00±49.39*#

2.2 大鼠腎臟組織中TLRs分子表達水平變化

12月 齡 組 和24月 齡 組TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR11表達水平均高于3月齡組，24月齡組TLR1和TLR3水平高于3月齡組，24月齡組TLR9水平高于3月齡組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；三組TLR6、TLR7、TLR10水平差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P＞0.05）；TLR8未檢測到。24月齡組TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5、TLR11水平高于12月齡組，差異均有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

2.3 TLRs信號通路分子MyD88在衰老大鼠腎臟組織中的表達改變

12月齡組和24月齡組MyD88水平高于3月齡組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；24月齡組MyD88水平高于12月齡組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖1。

2.4 NF-ΚB信號通路在在大鼠腎臟組織中的表達變化

利用Western blot檢測了NF-κB信號通路分子的表達變化，12月齡組和24月齡組IK-Bα和活化的磷酸化NF-κB p65（Phospho-NF-κB p65）水平高于3月齡組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；24月齡組NF-κB p65水平高于3月齡組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。24月齡組NFκB p65和Phospho-NF-κB p65水平高于12月齡組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖2。

2.5 炎癥因子在3組大鼠腎臟組織中的表達

24月齡組CCL3、CCL4、CCL5、CD80、TNF-α和IL-12b水平高于3月齡組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）；12月齡組CD80和IL-12b水平低于3月齡組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。24月齡組CCL3、CCL4、CCL5、CD80、TNF-α和IL-12b高于12月齡組，差異有統(tǒng)計學(xué)意義（P＜0.05）。見圖3。

3 討論

天然免疫（固有免疫）系統(tǒng)是由于其可以啟動炎癥和免疫反應(yīng)以消除感染和修復(fù)受損組織而首先被發(fā)現(xiàn)的。TLRs在天然免疫和獲得性（適應(yīng)性）免疫誘導(dǎo)中發(fā)揮重要作用。TLRs廣泛表達于樹突狀細胞、中性粒細胞、單核細胞、T細胞和B細胞等免疫細胞，也可表達于一些組織器官細胞。已發(fā)現(xiàn)腎小管上皮細胞可表達TLR1～TLR4和TLR6。TLRs亦可表達于腎小球細胞。例如TLR4 mRNA可以在足細胞、鮑曼氏囊和系膜細胞表達[9]。

TLRs（除TLR3）與病原體分子配體結(jié)合后可通過形成二聚體激活下游信號分子MyD88[10]。在靜止狀態(tài)下，IκBα和NF-κB結(jié)合而抑制NF-κB，使NF-κB在細胞質(zhì)中處于靜止狀態(tài)。當(dāng)MyD88被活化后可激活I(lǐng)KKβ，從而導(dǎo)致IκBα的素化而從IκB/NF-κB復(fù)合物中釋放出來，NF-κB由此活化并轉(zhuǎn)位入核，從而激活一系列致炎因子基因如IL-6、CCL3、CCL4、CCL5、ICAM1、CD80、TNF-α和IL-12b等的表達[11-12]。TLR3則可通過MyD88依賴性信號通路激活NF-κB。

近年研究發(fā)現(xiàn)TLRs與腎臟疾病的發(fā)生密切相關(guān)[13]。在系統(tǒng)性紅斑狼瘡性腎小球腎炎中TLR7和TLR9表達顯著升高[14]。TLR2和TLR4在缺血再灌注腎損傷中發(fā)揮重要作用。研究發(fā)現(xiàn)TLR2基因缺失的小鼠可以免受功能性和組織性局部缺血的損害[15]。TLR1和TLR9在去鐵鐵蛋白（Apoferritin）誘導(dǎo)的腎炎中表達升高，且發(fā)現(xiàn)TLR9多態(tài)性和人類多種疾病包括IgA腎病相關(guān)[16]。研究發(fā)現(xiàn)，TLR3配體可以通過NF-κB信號通路誘導(dǎo)CD80在人類腎臟足細胞的表達[17]。TLR2和TLR4在糖尿病腎病中發(fā)揮重要作用，特別是在高脂飲食的大鼠糖尿病模型中，TLR4和其下游的IKKβ/NF-κB通路明顯被激活[18-20]。但是，目前對TLRs系統(tǒng)在衰老腎臟中的作用尚不清楚。

本研究首次系統(tǒng)地分析了在大鼠腎臟衰老過程中TLRs信號通路分子、NF-κB信號通路分子以及炎癥因子CCL3、CCL4、CCL5、CD80、TNF-α和IL-12b的表達變化情況，發(fā)現(xiàn)在衰老腎臟中TLR1、TLR2、TLR3、TLR4、TLR5和TLR11的表達顯著升高，而TLR6、TLR7和TLR10則未見明顯變化。隨后檢測了TLRs信號通路下游分子MyD88表達，發(fā)現(xiàn)在衰老腎臟中MyD88水平也顯著升高。NF-κB是細胞內(nèi)調(diào)控各種促炎因子表達的關(guān)鍵性轉(zhuǎn)錄因子，已發(fā)現(xiàn)TLR活化后可以激活NF-κB信號通路。本實驗發(fā)現(xiàn)在衰老腎臟中NF-κB信號通路分子IκBα、NF-κB與Phospho-NF-κB表達明顯升高，相應(yīng)地，也發(fā)現(xiàn)在衰老腎臟組織中促進炎癥因子CCL3、CCL4、CCL5、CD80、TNF-α和IL-12b的表達明顯上調(diào)。這些結(jié)果顯示TLRs系統(tǒng)可能通過激活NF-κB信號通路、促進炎癥因子表達而在腎臟衰老過程中發(fā)揮重要作用。

近年研究表明免疫炎癥可能與衰老相關(guān)性疾病的發(fā)生有關(guān)。已發(fā)現(xiàn)在老年人群體內(nèi)炎癥因子如TNF-α、IL-6、C-反應(yīng)蛋白的血清水平顯著增加，但是對炎癥通過什么機制參與組織器官衰老則不太清楚。本研究顯示TLRs系統(tǒng)與腎臟器官衰老的發(fā)生密切相關(guān)，這為今后進一步明確腎臟衰老的機制提供了一種新方向。

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