袁利群 劉百祥 吳 楊 葉劍榮

1.湖南省人民醫(yī)院檢驗(yàn)科，湖南長(zhǎng)沙 410005；2.湖南省腫瘤醫(yī)院核醫(yī)學(xué)科，湖南長(zhǎng)沙 410006

小細(xì)胞肺癌（SCLC）屬于肺癌的一種尚未分化分型的類型，據(jù)統(tǒng)計(jì)其發(fā)生率在肺癌患者中占20%～25%，其惡性程度較高，癌細(xì)胞生長(zhǎng)和發(fā)展速度較快，更易較早的引起淋巴轉(zhuǎn)移，在各類肺癌的治療中，SCLC的預(yù)后相對(duì)較差，嚴(yán)重影響患者的生命安全[1-2]。肺鱗狀細(xì)胞癌主要來源于支氣管上皮細(xì)胞，屬于惡性上皮性腫瘤，低分化鱗狀細(xì)胞癌（PDSCC）在肺鱗狀細(xì)胞癌中分化程度低，多以中央型出現(xiàn)，顯微鏡主要表現(xiàn)出與小細(xì)胞癌類似的特征[3-4]。因此，臨床診斷過程中易將SCLC與PDSCC混淆，造成誤診，嚴(yán)重影響治療和患者預(yù)后，延誤治療時(shí)機(jī)。本研究選取SCLC和PDSCC患者作為研究對(duì)象，旨在探討兩種病癥的分子學(xué)差異，為臨床準(zhǔn)確診斷提高依據(jù)，現(xiàn)報(bào)道如下：

1 資料與方法

1.1 一般資料

病例資料選取2008年1月～2010年1月收治和確診的肺癌患者，患者均由3名以上臨床醫(yī)生會(huì)診以及石蠟病理切片檢驗(yàn)得出結(jié)論。包括SCLC患者38例，診斷標(biāo)準(zhǔn)參照免疫組化指標(biāo)Syn、ChrA、CK和CD56，其中男32例，女6例，年齡45～72歲，平均（55.0±5.4）歲；PDSCC患者46例，診斷標(biāo)準(zhǔn)參照WHO的相關(guān)病理分級(jí)標(biāo)準(zhǔn)判定為Ⅲ級(jí)分化，其中男38例，女8例，年齡48～74歲，平均（56.2±5.0）歲。肺癌患者臨床分期參照國(guó)際抗癌聯(lián)盟（UICC）的TNM分期標(biāo)準(zhǔn)，兩組患者分期情況詳見表1。兩組患者的年齡、性別及臨床分期情況比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），具有可比性。

表1 小細(xì)胞肺癌與低分化鱗狀細(xì)胞癌患者臨床分期情況（例）

1.2 方法

兩組患者均臨床取病理組織樣本，并分別以常規(guī)石蠟包埋制作成病理切片共6份，厚度為4μm，兩組均取切片行免疫組化檢驗(yàn)。具體方法：石蠟樣本熱抗原修復(fù)后以磷酸鹽緩沖液（PBS）沖洗，并以H2O2孵育抑制內(nèi)源性過氧化物酶的活性。切片加入山羊血清封閉處理，除血清部分，分別滴入鼠抗人Smac、Survivin、PCNA單克隆體，孵育后以PBS沖洗，再加入鏈霉卵白素工作液后PBS沖洗，滴入新鮮DAB溶液行顯色反應(yīng)，并于鏡下觀察染色適中后用蘇木素復(fù)染，行常規(guī)脫水、封片、觀察、記錄。

1.3 應(yīng)用試劑

鼠抗人單克隆體采用美國(guó)Cruz公司生產(chǎn)的Smac、北京中山生物技術(shù)有限公司生產(chǎn)的Survivin和PCNA。

1.4 觀察指標(biāo)

所有患者均隨訪2～4年，分別記錄兩組患者蛋白表達(dá)情況，并記錄患者2年預(yù)后情況。

1.5 診斷標(biāo)準(zhǔn)

Smac以細(xì)胞質(zhì)液呈現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒狀物質(zhì)且背景清晰為陽(yáng)性，并利用5個(gè)不同的高倍視野觀察計(jì)數(shù)，每個(gè)視野計(jì)數(shù)500個(gè)細(xì)胞，陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)≤10%計(jì)為（-），細(xì)胞含量在11%～25%計(jì)為（＋），含量在26%～50%計(jì)為（＋＋），≥51%計(jì)為（＋＋＋），認(rèn)為（-）（＋）（＋＋）為Smac蛋白低表達(dá)，（＋＋＋）為Smac高表達(dá)[5-7]。Survivin以細(xì)胞質(zhì)液呈現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒狀物質(zhì)且背景清晰為陽(yáng)性，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞在切片中的百分比，以0%計(jì)為0分，1%～25%計(jì)為1分，26%～50%計(jì)為2分，≥51%計(jì)為3分；取染色強(qiáng)度中無色計(jì)0分，淡黃色計(jì)1分，棕黃色計(jì)2分，棕褐色計(jì)3分，將兩項(xiàng)計(jì)分相加，總分為0計(jì)為（-），1～2分計(jì)（＋），3～4分計(jì)（＋＋），5～6分計(jì)（＋＋＋），認(rèn)為≤2分為陰性，＞2分為陽(yáng)性[8-9]。PCNA同樣以細(xì)胞質(zhì)液呈現(xiàn)棕黃色或棕褐色顆粒狀物質(zhì)且背景清晰為陽(yáng)性，取高倍視野5次觀察切片瘤細(xì)胞數(shù)量，計(jì)算陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)占總細(xì)胞數(shù)的百分比，≤25%計(jì)為Ⅰ級(jí)，26%～50%計(jì)為Ⅱ級(jí)，51%～75%計(jì)為Ⅲ級(jí)，≥76%計(jì)為Ⅳ級(jí)[10]。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

獲得數(shù)據(jù)分別錄入軟件包SPSS 11.0，并建立數(shù)據(jù)庫(kù)進(jìn)行數(shù)據(jù)處理與分析，計(jì)數(shù)資料采用百分率表示，組間對(duì)比采用χ2檢驗(yàn)。以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 兩組Smac蛋白表達(dá)

SCLC組患者Smac蛋白低表達(dá)率較高，明顯高于PDSCC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。

表2 兩組患者Smac蛋白的高、低表達(dá)比較[n（%）]

2.2 兩組Survivin蛋白表達(dá)

SCLC組患者Survivin蛋白陽(yáng)性表達(dá)率較高，明顯高于PDSCC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表3。

表3 兩組患者Survivin蛋白的陽(yáng)性和陰性表達(dá)比較[n（%）]

2.3 兩組PCNA蛋白表達(dá)

SCLC組患者PCNA蛋白Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ級(jí)表達(dá)率較低，且明顯低于PDSCC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表4。

表4 兩組患者PCNA分級(jí)表達(dá)比較[n（%）]

2.4 預(yù)后情況

兩組患者1年生存率差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＞0.05），2年生存率PDSCC組明顯低于SCLC組（P＜0.05）。PDSCC組1年和2年生存率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05），隨著時(shí)間的進(jìn)展患者生存率明顯降低，SCLC組1、2年生存率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.05）。見表5。

表5 兩組患者2年預(yù)后情況比較[n（%）]

3 討論

肺癌是臨床多發(fā)病，被認(rèn)為是當(dāng)今世界惡性腫瘤中誘導(dǎo)人類死亡的主要因素之一[11-12]，由于肺癌的病理類型、誘因、分化程度、分期等受多因素影響，造成臨床的診斷和治療困難重重，由此也使廣大醫(yī)療工作者更加確定，明確肺癌種類對(duì)于治療和預(yù)后具有重要意義[13-14]。肺癌的病理學(xué)診斷主要采用病理切片顯微鏡下檢測(cè)癌細(xì)胞量來進(jìn)行確診和分期，而SCLC和PDSCC在顯微鏡下的表達(dá)相近，易造成臨床診斷的混淆[15-16]，造成誤診從而延誤治療時(shí)機(jī)。因此深入研究SCLC和PDSCC在臨床的表達(dá)特異性對(duì)于提高臨床診斷準(zhǔn)確率、完善預(yù)后具有重要意義。

本組研究的患者均來源于收診的肺癌患者，均有完整的病例檔案，為提高研究的準(zhǔn)確性，對(duì)于相關(guān)病例均采用3位以上醫(yī)生會(huì)診的方法，并結(jié)合臨床的相關(guān)診斷標(biāo)準(zhǔn)細(xì)致診斷，從而減少誤診率，提高臨床研究的有效性。研究通過免疫組化方法對(duì)切片進(jìn)行處理和鏡下觀察，并對(duì)Smac、Survivin和PCNA的表達(dá)結(jié)果進(jìn)行比較分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，SCLC組患者的Smac蛋白低表達(dá)率、Survivin蛋白陽(yáng)性表達(dá)率均明顯高于PDSCC組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，提示Smac、Survivin在臨床生化檢驗(yàn)中具有特異性，可作為區(qū)分SCLC和PDSCC的檢驗(yàn)指標(biāo)。而PCNA蛋白Ⅰ、Ⅱ、Ⅳ級(jí)表達(dá)率明顯低于PCNA組，Ⅲ級(jí)表達(dá)率明顯高于PCNA組，認(rèn)為由于其分級(jí)表達(dá)不具有兩端性，因而尚不能判定PCNA對(duì)SCLC和PDSCC的診斷具有特異性，仍需進(jìn)一步探討。

同時(shí)，本組研究還對(duì)SCLC和PDSCC患者的2年預(yù)后進(jìn)行了統(tǒng)計(jì)比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，兩組患者的1年生存率無差異，但2年生存率SCLC組明顯高于PDSCC組，提示隨著時(shí)間的進(jìn)展，PDSCC患者的預(yù)后明顯偏差，這也為臨床制訂相對(duì)有效的治療方案和深入研究更有效的維持患者生命的治療方法提出了更高的要求。

本研究認(rèn)為，Smac蛋白低表達(dá)、Survivin蛋白陽(yáng)性可作為SCLC和PDSCC的檢驗(yàn)和區(qū)分指標(biāo)之一，而PCNA蛋白分級(jí)是否具有明確的指導(dǎo)意義仍需進(jìn)一步的相關(guān)研究來認(rèn)證。當(dāng)然，本組研究也存在局限性，一是研究樣本數(shù)量相對(duì)不足，可能對(duì)研究結(jié)果產(chǎn)生影響；二是即便是通過多名醫(yī)生會(huì)診來確定劃分兩組疾病的標(biāo)準(zhǔn)，但仍不能保證結(jié)果的完全準(zhǔn)確，這也可能對(duì)研究結(jié)果產(chǎn)生影響。目前臨床的相關(guān)研究鮮見，應(yīng)呼吁更多的研究者提供相關(guān)的臨床依據(jù)，以便于提高臨床對(duì)SCLC和PDSCC的診斷準(zhǔn)確性。

[1]胡穎.重組人Smac及Smac-PTD的制備與初步功能分析[D].重慶：第三軍醫(yī)大學(xué)，2008.

[2]Chen G，Wang XL，Liu YP，et al.Expressions of FEZ1 and surviving，and their significance in small cell lung cancer and squamous cell lung carcinoma[J].Journal of clinical oncology，2008，7（4）：207-209.

[3]Ng CP，Bonavida B.X-linked inhibitor of apoptosis（XIAP）blocks Apo2 ligand/tumor necrosis factor-related apoptosis-inducing ligandmediated apoptosis of prostate cancer cells in the presence of mitochondrial activation：sensitization by overexpression of second mitochondria-derived activator of caspase/direct IAP-binding protein with low pl（Smac/DIABLO）[J].Mol Cancer Ther，2002，1（12）：1051-1058.

[4]Fulda S，Wick W，Weller M，et al.Smac agonists sensitize for Apo2L/TRAIL or anticancer drug-induced apoptosis and induce regression of malignant glioma in vivo[J].Nat Med，2002，8（8）：808-815.

[5]趙進(jìn)明，朱志華，吳秋良，等.Smac在I-II期非小細(xì)胞肺癌組織中的表達(dá)及其臨床意義[J].癌癥，2006，25（5）：631-634.

[6]Yoo NJ，Kim HS，Kim SY，et al.Immunohistochemical analysis of Smac/DIABLO expression in human carcinomas and sarcomas[J].APMIS，2003，111（3）：382-388.

[7]Du C，F(xiàn)ang M，Li Y，et al.Smac，a mitochondrial protein that promotes cytochrome c-dependent caspase activation by eliminating IAP inhibition[J].Cell，2010，102（102）：33-38.

[8]李艷，王新允，劉婷，等.survivin mRNA及蛋白在肺癌組織芯片中的表達(dá)及意義[J].腫瘤，2006，26（9）：65-67.

[9]綦俊，張?jiān)诳眨鄷?survivin蛋白在人非小細(xì)胞肺癌中的表達(dá)及其與bcl-2、HSP90蛋白表達(dá)和細(xì)胞凋亡的關(guān)系[J].腫瘤防治研究，2009，37（10）：851-854.

[10]趙雨占，朱明華.P53、PCNA在肺癌中的表達(dá)與生物學(xué)行為的關(guān)系[J].河北醫(yī)學(xué)，2004，10（11）：78-79.

[11]王昌惠.肺癌轉(zhuǎn)移機(jī)制的研究進(jìn)展[J].同濟(jì)大學(xué)學(xué)報(bào)，2011，2（2）：56-59.

[12]廖美琳，周允中.肺癌[M].3版.上海：上海科學(xué)技術(shù)出版社，2012：100-150.

[13]Krepela E，Prochazka J，F(xiàn)iala P，et al.Expression of apoptosome pathway-related transcripts in non-small cell lung cancer[J].J Cancer Res Clin Oncol，2006，132（1）：57-68.

[14]Sekimura A，Konishi A，Mizuno K，et al.Expression of Smac/DIABLO is a novel prognostic marker in lung cancer[J].Oncol Rep，2004，11（4）：797-802.

[15]虞紅珍，吳強(qiáng)，秦蓉，等.聯(lián)合組織學(xué)與細(xì)胞學(xué)對(duì)肺小細(xì)胞癌的診斷和鑒別診斷[J].臨床與實(shí)驗(yàn)病理學(xué)雜志，2012，1（1）：28-30.

[16]ZHAO Jinming，ZHU Zhihua，WU Qiuliang，et al.Expression of Smac in StageⅠ-ⅡNon-small Cell Lung Cancer and Its Clinical Significance[J].Chinese Journal of Cancer，2006，25（5）：631-634.