賈建桃， 張慧英△， 郭建紅， 李 晨， 呂敏麗，張麗麗， 張翠英， 李寶紅， 趙中夫， 韓德五， CHENG Ji

(1 長治醫(yī)學(xué)院病理生理學(xué)教研室，山西 長治046000;2山西醫(yī)科大學(xué)肝病研究所，山西 太原030001;3長治醫(yī)學(xué)院生理學(xué)教研室，山西 長治046000;4山西醫(yī)科大學(xué)第二醫(yī)院ICU，山西 太原030001;5長治醫(yī)學(xué)院肝病研究所，山西 長治046000;6美國南加州大學(xué)KECK 醫(yī)學(xué)院肝病研究中心，加利福尼亞州 洛杉磯90089)

肝肺綜合征(hepatopulmonary syndrome，HPS)是肝硬化早期出現(xiàn)的一種肺微血管紊亂性疾?。?］，一旦發(fā)生，即可加重原發(fā)肝臟疾病并促進(jìn)其它并發(fā)癥的發(fā)生。葡萄糖調(diào)節(jié)蛋白78(glucose-regulated protein 78，GRP78)不僅是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的標(biāo)記分子［2］，而且其高表達(dá)也與多種疾病的發(fā)生密切相關(guān)［3］。我們前期工作已經(jīng)證實(shí)，HPS 大鼠肺微血管數(shù)量隨病程進(jìn)展逐漸增多［4］;肝硬化時形成的腸源性內(nèi)毒素血癥作為內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激的重要應(yīng)激原，激活肺組織的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)導(dǎo)致GRP78 表達(dá)增高，很可能是HPS發(fā)病的關(guān)鍵因素［5］。由于GRP78 過表達(dá)在多種疾病發(fā)生中具有促增殖和抑凋亡作用［6-7］，由此，我們推測在HPS 發(fā)病中，高表達(dá)的GRP78 也可能是通過該種機(jī)制導(dǎo)致了肺微血管的重構(gòu)。本項(xiàng)研究通過觀察復(fù)合致病因素誘導(dǎo)的肝硬化合并HPS 大鼠發(fā)病過程中肺組織GRP78 以及肺微血管增生和凋亡相關(guān)因子的表達(dá)變化，探討GRP78 對肺微血管重構(gòu)的作用機(jī)制，為臨床HPS 以及其它并發(fā)癥的預(yù)防和治療提供理論依據(jù)。

材 料 和 方 法

1 材料

1.1 動物 Wistar 清潔級大鼠，由山西醫(yī)科大學(xué)動物實(shí)驗(yàn)中心供應(yīng)。

1.2 主要試劑 兔抗大鼠GRP78 多克隆抗體購自Sigma;血管內(nèi)皮生長因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、C/EBP 同源蛋白(C/EBP homologous protein，CHOP)/生長阻滯及DNA 損傷誘導(dǎo)蛋白153(growth arrest and DNA damage-inducible protein 153，GADD153)多克隆抗體購自Santa Cruz;caspase-12、核因子(nuclear fator，NF)-κB 、Bcl-2 和Ⅷ因子相關(guān)抗原(factor Ⅷ-related antigen，F(xiàn)Ⅷ-RAg)多克隆抗體均購自北京博奧森生物技術(shù)有限公司;辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗兔IgG 購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司;鼠抗兔3-磷酸甘油醛脫氫酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH)單克隆抗體和辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗小鼠IgG 均購自碧云天生物技術(shù)研究所;SuperECL Plus 超敏發(fā)光液和BCA 法蛋白定量試劑盒購自普利萊基因技術(shù)有限公司;Trizol 試劑盒和RT-PCR 試劑盒購自Gibco;TaqDNA 聚合酶購自Promega;VEGF 和GAPDH 引物由生物工程上海有限公司合成。

2 方法

2.1 動物分組與模型建立 雄性Wistar 大鼠，體重200 ～240 g，隨機(jī)分為4 周、6 周、8 周3 個時點(diǎn)組，每個時點(diǎn)組隨機(jī)分為正常對照組和模型組。對照組動物給予標(biāo)準(zhǔn)飼料和飲用礦物質(zhì)水，模型組動物用復(fù)合致病因素法復(fù)制肝硬化合并HPS 模型［4-5］。分別于各時點(diǎn)，全麻、無菌、無內(nèi)毒素條件下經(jīng)腹主動脈采集血液，3 000 r/min 離心15 min，吸取血漿，－70℃保存?zhèn)溆?取部分肝組織和肺組織立即置于液氮中保存?zhèn)溆茫溆嘟M織用中性甲醛緩沖液固定，用于組織學(xué)研究。

2.2 免疫組化法檢測肺組織GRP78、FⅧ-RAg、CHOP/GADD153、caspase-12、Bcl-2 和NF-κB 的表達(dá)

以石蠟包埋的肺組織標(biāo)本制備4 μm 切片，經(jīng)脫蠟、水化和抗原修復(fù)處理后，采用SP 法，遵照說明書進(jìn)行(Ⅰ抗分別為兔抗大鼠GRP78、F Ⅷ-RAg、GADD153、caspase-12、Bcl-2 和NF-κB 多 克 隆 抗體)，DAB 顯色，蘇木精復(fù)染，脫水、透明、封片、鏡檢。用PBS 代替Ⅰ抗作為陰性對照。棕黃色顆粒為染色陽性顆粒，采用BI-2000 醫(yī)學(xué)圖像分析系統(tǒng)(成都泰盟科技有限公司)，在光學(xué)顯微鏡下每張切片隨機(jī)取10 個視野，分別計(jì)算細(xì)胞平均吸光度值(NF-κB 分別計(jì)數(shù)每個視野中胞漿陽染細(xì)胞和胞核陽染細(xì)胞占總細(xì)胞的百分比)，取平均值進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析。

2.3 RT-PCR 法檢測肺組織中VEGF mRNA 的表達(dá)

取肺組織100 mg，提取總RNA，紫外分光光度計(jì)檢測波長為260 nm 和280 nm 時的吸光度(A)，兩者的比值代表RNA 純度及濃度。取50 μg 總RNA 按照說明書進(jìn)行逆轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增。VEGF 引物序列上游引物5'-CTG CTC TCT TGG GTG CAC TG-3'，下游引物5'-CTG CGG ATC TTG GAC AAA CA-3'，擴(kuò)增片段長度465bp;GAPDH 為內(nèi)參照，上游引物5'-GGT CAT CAA CGG GAA ACC C-3'，下游引物5'-TCT GAG TGG CAG TGA TGG CA-3'，擴(kuò)增片段長度450 bp。擴(kuò)增參數(shù):95 ℃預(yù)變性2 min，95 ℃30 s，58 ℃30 s，72 ℃30 s，進(jìn)行30 個循環(huán)，最后72 ℃5 min。DNA標(biāo)準(zhǔn)(D12000)確定PCR 產(chǎn)物大小，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳，于凝膠成像分析儀上進(jìn)行光密度掃描并采用Quantity One 凝膠分析系統(tǒng)(Bio-Rad)測定目的條帶與GAPDH 條帶的吸光度，以兩者的比值表示目的mRNA 的相對含量。

2.4 Western blotting 法檢測肺組織中VEGF 的表達(dá)

取肺組織超聲裂解后，BCA 法蛋白定量。取150 μg 蛋白，變性，上樣，經(jīng)10% SDS-PAGE 凝膠電泳后，電轉(zhuǎn)移至硝酸纖維素膜，封閉后加入兔抗大鼠VEGF 多克隆抗體(1∶800 稀釋)4 ℃過夜，洗滌后加入辣根酶標(biāo)記山羊抗兔IgG(1∶800 稀釋)室溫1 h，洗滌后加ECL 超敏發(fā)光液，X 線膠片曝光、顯影。以GAPDH 為內(nèi)參照。采用分子生物學(xué)圖像分析系統(tǒng)進(jìn)行定量掃描測定條帶灰度值，將每個樣本的灰度值與相應(yīng)GAPDH 的灰度值相比，計(jì)算蛋白的表達(dá)水平。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用SPSS 13.0 軟件分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(mean±SD)表示，單因素方差分析法比較多個樣本均數(shù)，采用LSD-t 檢驗(yàn)法進(jìn)行均數(shù)之間的兩兩比較，線性相關(guān)法分析兩兩指標(biāo)間的相關(guān)性，以P ＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

1 肺組織中GRP78、FⅧ-RAg、CHOP/GADD153、caspase-12、Bcl-2 和NF-κB 的表達(dá)

免疫組織化學(xué)結(jié)果顯示，GRP78 和FⅧ-RAg 在胞漿和胞膜上均有表達(dá)，胞核未見著色;模型組兩者染色強(qiáng)度和數(shù)量均隨病程進(jìn)展逐漸升高并顯著高于對照組，GRP78 在8 周組顯著高于4 周組(P ＜0.05)，F(xiàn)Ⅷ-RAg 8 周組與4 周和6 周組均有顯著差異(P ＜0.05)。CHOP/GADD153 和caspase-12 在胞漿中表達(dá);模型組兩者染色強(qiáng)度和數(shù)量隨病程進(jìn)展逐漸降低，8 周組CHOP/GADD153 顯著低于4 周和6 周組(P ＜0.05)，caspase-12 在6 周和8 周組明顯低于4 周組(P ＜0.05)。Bcl-2 在胞漿中表達(dá);模型組染色強(qiáng)度和數(shù)量隨病程進(jìn)展呈增高趨勢，且明顯高于正常對照組(P ＜0.05)。NF-κB 在正常對照組僅有少量表達(dá)，模型組隨病程進(jìn)展逐漸增多，尤其以胞核的表達(dá)增加明顯，見圖1 ～6 和表1 ～3。

2 肺組織中VEGF mRNA 和蛋白的表達(dá)

模型組VEGF mRNA 表達(dá)在4 周組和6 周組顯著高于正常對照組(P ＜0.05);蛋白的表達(dá)隨病程進(jìn)展而逐漸增加(P ＜0.05)，見圖7、8。

Figure 1. The expression of GRP78 protein in lung tissues detected by immunohistochemistry (×400). A:control;B:HPS at the 4th week;C:HPS at the 6th week;D:HPS at the 8th week.圖1 HPS 大鼠肺組織GRP78 蛋白表達(dá)變化

Figure 2. The expression of FⅧ-RAg protein in lung tissues detected by immunohistochemistry(×400). A:control;B:HPS at the 4th week;C:HPS at the 6th week;D:HPS at the 8th week.圖2 HPS 大鼠肺組織FⅧ-RAg 蛋白表達(dá)變化

Figure 3. The expression of CHOP/GADD153 protein in lung tissues detected by immunohistochemistry (×400).A:control;B:HPS at the 4th week;C:HPS at the 6th week;D:HPS at the 8th week.圖3 HPS 大鼠肺組織CHOP/GADD153 蛋白表達(dá)變化

Figure 4. The expression of caspase-12 protein in lung tissues detected by immunohistochemistry (×400). A:control;B:HPS at the 4th week;C:HPS at the 6th week;D:HPS at the 8th week.圖4 HPS 大鼠肺組織caspase-12 蛋白表達(dá)變化

Figure 5. The expression of Bcl-2 protein in lung tissues detected by immunohistochemistry (×400). A:control;B:HPS at the 4th week;C:HPS at the 6th week;D:HPS at the 8th week.圖5 HPS 大鼠肺組織Bcl-2 蛋白表達(dá)變化

Figure 6. The expression of NF-κB protein in lung tissues detected by immunohistochemistry (×1 000). A:control;B:HPS at the 4th week;C:HPS at the 6th week;D:HPS at the 8th week.圖6 HPS 大鼠肺組織NF-κB 蛋白表達(dá)變化

表1 各時點(diǎn)對照組和模型組HPS 大鼠肺組織GRP78、FⅧ-RAg 和CHOP/GADD153 水平變化Table 1. Content of GRP78，F(xiàn)Ⅷ-RAg and CHOP/GADD153 of lung tissue in control and HPS groups(mean±SD)

表2 各時點(diǎn)對照組和模型組HPS 大鼠肺組織caspase-12 和Bcl-2 水平變化Table 2. Content of caspase-12 and Bcl-2 of lung tissue in control and HPS groups(mean±SD)

表3 各時點(diǎn)對照組和模型組HPS 大鼠肺組織NF-κB 水平變化Table 3. Content of NF-κB of lung tissue in control and HPS groups(mean±SD)

Figure 7. The mRNA level of VEGF in rat lung tissues from control and HPS groups. 1:control at the 4th week;2:HPS at the 4th week;3:control at the 6th week;4:HPS at the 6th week;5:control at the 8th week;6:HPS at the 8th week. Mean±SD. * P ＜0.05 vs control.圖7 大鼠肺組織VEGF mRNA 的表達(dá)

3 相關(guān)性分析

肺組織GRP78 蛋白表達(dá)水平與肺組織VEGF(r=0.7750，P ＜0.01)和FⅧ-RAg 蛋白(r =0.7824，P ＜0.01)的表達(dá)呈正相關(guān)，與CHOP/GADD153(r =－0.6921，P ＜0.01)和caspase-12(r=－0.7012，P ＜0.01)的表達(dá)呈負(fù)相關(guān)。

討 論

內(nèi)質(zhì)網(wǎng)(endoplasmic reticulum，ER)是細(xì)胞內(nèi)重要的細(xì)胞器，內(nèi)毒素［5］、缺氧和Ca2+紊亂等是引起ER 應(yīng)激(ER stress，ERS)的重要應(yīng)激原，并啟動內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)信號通路:(1)通過減少蛋白質(zhì)的翻譯，阻止未折疊蛋白進(jìn)一步積聚;(2)上調(diào)分子伴侶GRP78 和GRP94 蛋白以及有利于蛋白折疊和恢復(fù)內(nèi)環(huán)境功能的各種蛋白的基因表達(dá)，增強(qiáng)蛋白折疊能力，在后期則通過泛素－蛋白酶體系統(tǒng)清除誤折疊蛋白;(3)免疫和抗凋亡介質(zhì)NF-κB 激活;(4)內(nèi)質(zhì)網(wǎng)功能嚴(yán)重受損時，啟動凋亡途徑清除損傷細(xì)胞，包括CHOP/GADD153 的轉(zhuǎn)錄激活、c-Jun 氨基端激酶通路的激活和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)相關(guān)凋亡蛋白酶caspase-12的激活［8］。在不同病理情況下，依據(jù)ERS 的程度，促細(xì)胞生存和促細(xì)胞凋亡信號相互作用，最終決定細(xì)胞的存亡［9-11］。本項(xiàng)研究中，HPS 動物肺組織中內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激相關(guān)信號分子GRP78、caspase-12、GADD153和NF-κB 的變化，進(jìn)一步證明了內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激在HPS發(fā)病中的重要作用。

Figure 8. The protein level of VEGF in rat lung tissues from control and HPS groups. 1:control at the 4th week;2:HPS at the 4th week;3:control at the 6th week;4:HPS at the 6th week;5:control at the 8th week;6:HPS at the 8th week. Mean ±SD. * P ＜0.05 vs control;△P ＜0.05 vs 4th week;#P ＜0.05 vs 6th week.圖8 大鼠肺組織VEGF 蛋白的表達(dá)

肺微血管重構(gòu)是肝肺綜合征發(fā)病的中心環(huán)節(jié)。FⅧ-RAg 是特異性血管標(biāo)記物，其含量的變化可較為直觀地反映血管密度。VEGF 不僅具有特異性促血管內(nèi)皮細(xì)胞增生和血管生成的特征，而且還具有改變細(xì)胞外基質(zhì)的作用，是生理和病理過程中多數(shù)因子促進(jìn)血管重構(gòu)的共同通路。研究證實(shí)，GRP78可以直接或者通過VEGF 促進(jìn)血管增生［12-13］。本項(xiàng)研究中，肺組織中FⅧ-RAg 及VEGF 蛋白表達(dá)隨病程進(jìn)展逐漸升高，而且增高的GRP78 蛋白與升高的VEGF 和FⅧ-RAg 分別呈正相關(guān)。表明在HPS 發(fā)病過程中，GRP78 很可能是引起肺微血管重構(gòu)的關(guān)鍵因子。

血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖和凋亡的力量對比是決定血管增生程度的重要機(jī)制。GRP78 具有正向和負(fù)向雙重調(diào)節(jié)細(xì)胞生長的作用［3，14］。生理情況下，GRP78在胞漿中表達(dá)，發(fā)揮促進(jìn)細(xì)胞凋亡、抑制血管增殖的作用［2］;病理情況下，GRP78 在胞漿中表達(dá)異常增高，并轉(zhuǎn)運(yùn)至胞膜作為受體發(fā)揮刺激細(xì)胞增殖、抑制凋亡和促進(jìn)新血管生成等作用［2，6-7］。GRP78 的促增殖作用是通過與多種胞外配體(如activated α2-macroglobulin 和Kringle 5 等)或內(nèi)皮細(xì)胞表面錨定蛋白(如表皮生長因子家族的Cripto 蛋白)形成復(fù)合物而發(fā)揮的［7］。GRP78 也可以通過活化NF-κB 促進(jìn)細(xì)胞增殖，這種作用是通過Bcl-2 抗凋亡途徑、MAPK 信號通路和PI3-激酶通路所發(fā)揮的［15］。目前認(rèn)為GRP78 可能的抑凋亡機(jī)制如下，通過其自身的ATP結(jié)構(gòu)域與caspase-7 和caspase-12 形成復(fù)合物，阻止caspase-12 的釋放［16-17］;下調(diào)活化轉(zhuǎn)錄因子6 或蛋白激酶R 樣內(nèi)質(zhì)網(wǎng)激酶通路，減少CHOP/GADD153 的產(chǎn)生;對抗Bcl-2 家族中促凋亡蛋白的作用［18］。此外，Bcl-2 家族中具有抗凋亡作用的Bcl-2 等分子還可以下調(diào)CHOP/GADD153 而發(fā)揮抗凋亡作用［19-20］。本研究觀察到在HPS 發(fā)病過程中，GRP78 表達(dá)逐漸增高，與表達(dá)逐漸減少的caspase-12 和CHOP/GADD153 顯著相關(guān)，抗凋亡蛋白Bcl-2 表達(dá)逐漸增高，NF-κB 活化，說明在HPS 發(fā)病過程中，GRP78 的高表達(dá)很可能是通過VEGF 途徑促進(jìn)細(xì)胞增殖和通過阻止caspase-12 釋放以及減少CHOP 表達(dá)抑制凋亡，促進(jìn)了肺微血管的重構(gòu)。

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