苗 成， 李金國， 苗 芳， 焦 鵬， 田 華， 方永奇， 秦樹存△， 姚樹桐，△

(泰山醫(yī)學(xué)院1動脈粥樣硬化研究所，山東省高校重點實驗室，2基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院，山東 泰安271000)

心腦血管疾病位居人類疾病譜首位，動脈粥樣硬化(atherosclerosis，AS)是其主要病理基礎(chǔ)，而泡沫細胞尤其巨噬細胞源性泡沫細胞是AS 的重要標志，并在其發(fā)生發(fā)展中起著重要作用［1］。由清道夫受體介導(dǎo)的巨噬細胞對氧化低密度脂蛋白(oxidized lowdensity lipoprotein，ox-LDL)的無限制攝取是泡沫細胞形成的重要環(huán)節(jié)，其中CD36 是巨噬細胞表面主要識別、內(nèi)吞ox-LDL 的清道夫受體，其結(jié)合和攝取的ox-LDL 占巨噬細胞結(jié)合和攝取修飾脂質(zhì)的50%以上［2］，因此調(diào)控CD36 表達可能對抑制泡沫細胞形成、阻止AS 進展具有重要意義。槲皮素(quercetin，QUE)是廣泛存在于蜂膠、紅酒、水果和茶葉中的小分子黃酮類化合物，具有抗氧化、抗炎、抗腫瘤、調(diào)血脂、降血壓等藥理作用［3-4］。本課題組既往研究證實，QUE 可抑制ox-LDL 所誘導(dǎo)的巨噬細胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積［5］，但其機制尚不清楚。本研究在ox-LDL 誘導(dǎo)的巨噬細胞源性泡沫細胞模型上，研究槲皮素對CD36表達及氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響，以探討其調(diào)控巨噬細胞泡沫化的機制。

材 料 和 方 法

1 材料與試劑

QUE、油紅O 和2’，7’-二氯熒光素二乙酸脂(2’，7’-dichlorofluorescein diacetate，DCFH-DA)為Sigma 產(chǎn)品;DMEM 高糖培養(yǎng)基和RIPA 裂解液分別購自Gibco 和Solarbio;兔抗CD36 和β-actin 抗體購自Santa Cruz;辣根過氧化物酶標記山羊抗兔IgG 為北京中杉金橋產(chǎn)品;Trizol 試劑購自Invitrogen;cDNA合成試劑盒和Real Master Mix(SYBR Green)試劑盒為北京天根公司產(chǎn)品;增強化學(xué)發(fā)光(enhanced chemiluminescence，ECL)試劑盒和PVDF 膜分別為Pierce 和Millpore 產(chǎn)品;乳酸脫氫酶(lactate dehydrogenase，LDH)和丙二醛(malondialdehyde，MDA)測定試劑盒購自南京建成生物工程研究所，其余試劑均為分析純產(chǎn)品。

2 方法

2.1 LDL 分離與氧化 按照文獻［6］方法制備ox-LDL，即采用序列超速離心法分離健康人新鮮血漿LDL，用不含EDTA 的PBS 液透析48 h，隨后在含10 μmol/L CuSO4的PBS 液(pH 7.2)中37 °C 溫育透析18 h，最后在含100 μmol/L EDTA 的PBS 中4 ℃透析24 h。過濾除菌，BCA 試劑定量蛋白，用PBS 調(diào)蛋白濃度至1 g/L，4 ℃保存?zhèn)溆谩y定硫代巴比妥酸反應(yīng)物質(zhì)MDA 的濃度(＞30 μmol/g);且瓊脂糖凝膠電泳顯示ox-LDL 電泳遷移率增快，為LDL 的2.0 ～2.5 倍。

2.2 細胞培養(yǎng)與實驗分組 鼠源RAW264.7 巨噬細胞由中國科學(xué)院上海生物化學(xué)與細胞生物學(xué)研究所細胞庫提供，用DMEM 高糖培養(yǎng)基(含10%胎牛血清、青霉素1 ×105U/L 和鏈霉素100 mg/L)于37℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。隨機分為(1)正常對照(control)組:培養(yǎng)液中常規(guī)培養(yǎng);(2)ox-LDL 組:培養(yǎng)液中加入100 mg/L ox-LDL;(3)QUE 預(yù)處理組:培養(yǎng)液中先加入QUE (20、40 和80 μmol/L)預(yù)處理30 min，再加入100 mg/L ox-LDL。除QUE 預(yù)處理組外，其它各組均加入體積分數(shù)為0.1%的二甲亞砜(dimethylsulfoxide，DMSO)，培養(yǎng)24 h 收集細胞。

2.3 油紅O 染色觀察細胞內(nèi)脂滴變化［6］將細胞培養(yǎng)于放有無菌蓋玻片的6 孔培養(yǎng)板內(nèi)，細胞經(jīng)處理后，PBS 潤洗，4%鈣甲醛溶液固定，油紅O 染色液染色15 min，蘇木素復(fù)染。Olympus BX51 顯微鏡觀察，細胞內(nèi)脂質(zhì)呈紅色，細胞核呈藍色。每張爬片隨機選取5 個區(qū)域，采用Image-Pro Plus 6. 0 (Media Cybernetics)圖像分析軟件分析實驗結(jié)果，細胞內(nèi)脂滴含量以細胞平均積分吸光度(integrated absorbance，IA)值表示。

2.4 細胞培養(yǎng)液中LDH 活性和MDA 含量檢測

將細胞培養(yǎng)于6 孔板中，經(jīng)處理后收集細胞培養(yǎng)液，1 500 r/min 離心10 min，收集上清，按照試劑盒說明書比色法測定細胞培養(yǎng)液中LDH 活性和MDA 含量。

2.5 DCFH-DA 熒光探針檢測細胞活性氧( reactive oxygen species，ROS) 水平 將細胞接種于96 孔板，經(jīng)處理后，裝載探針，使DCFH-DA 終濃度為10 μmol/L。37 ℃孵育30 min 后，無血清培養(yǎng)液洗細胞3 次。多功能酶標儀檢測，激發(fā)波長為488 nm，發(fā)射波長為525 nm。以對照組ROS 水平為100%，其它各組ROS 水平以其熒光強度占對照組熒光強度的百分比表示。

2.6 Real-time PCR 檢測CD36 mRNA 表達 按照Trizol 試劑說明提取各組細胞總RNA。按RNA 逆轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA 產(chǎn)物。按real-time PCR試劑盒說明書準備20 μL PCR 擴增反應(yīng)體系:SYBR Green 9 μL，上、下游引物各2 μL，cDNA 2 μL，雙蒸水5 μL。在real-time PCR 儀(Rotor-Gene Q 型，上海Qiagen 公司)上反應(yīng)，條件為94 ℃預(yù)變性10 min，94℃20 s，55℃30 s，70 ℃30 s，40 個循環(huán)。β-actin 作為內(nèi)參照。CD36 上游引物5’-GAACCTATTGAAGGCTTACATCC-3’，下游引物5’-CCCAGTCACTTGTGTTTTGAAC-3’，擴增長度246 bp;β-actin 上游引物5’-CGGGGACCTGACTGACTACC-3’，下游引物5’-AGGAAGGCTGGAAGAGTGC -3’，擴增長度251 bp。

2.7 Western blotting 檢測CD36 蛋白表達 按照RIPA 蛋白提取試劑盒說明書提取各組細胞蛋白，經(jīng)定量、變性處理并進行十二烷基硫酸鈉-聚丙烯酰胺凝膠電泳(10%分離膠)后電轉(zhuǎn)印至PVDF 膜，5%脫脂奶粉封閉后分別用兔抗CD36 (1∶300)和β-actin 抗體(1∶500)多克隆抗體室溫孵育3 h，洗膜后用辣根過氧化物酶標記相應(yīng)II 抗孵育2 h。免疫條帶用ECL 法顯示，暗室曝光，采用Image-Pro Plus 軟件分析蛋白條帶IA 值，以CD36 IA 值與β-actin IA 值的比值反映CD36 相對水平。

3 統(tǒng)計學(xué)處理

采用SPSS 13.0 統(tǒng)計軟件分析，數(shù)據(jù)用均數(shù)±標準差(mean±SD)表示，多組間比較應(yīng)用單因素方差分析，組間兩兩比較應(yīng)用q 檢驗，以P ＜0.05 為差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

結(jié) 果

1 QUE 抑制ox-LDL 所誘導(dǎo)的RAW264.7 巨噬細胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積

正常對照組油紅O 染色陽性細胞少或無;ox-LDL 組油紅O 染色陽性細胞遍布;QUE (20、40 和80 μmol/L)預(yù)處理組油紅O 染色陽性細胞明顯減少，其平均IA 值分別為ox-LDL 組的80.6%、62.9%和51.8% (后兩者P ＜0.01)，見圖1。

Figure 1. QUE reduced ox-LDL-induced intracellular lipid accumulation in RAW264.7 cells. Cells were pretreated with 20，40 and 80 μmol/L of QUE for 30 min and then treated with ox-LDL (100 mg/L)for 24 h. The intracellular lipid droplets were stained by oil red O (×1 000). Mean±SD. n=6. ＊＊P ＜0.01 vs control group;##P ＜0.01 vs ox-LDL group.圖1 QUE 減輕ox-LDL 所誘導(dǎo)的RAW264.7 細胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積

2 QUE 降低ox-LDL 所致的細胞LDH 釋放

不同濃度的QUE 均可顯著抑制ox-LDL 所致的LDH 釋放，分別較ox-LDL 組降低25.4%、33.3%和42.1% (P ＜0.05 或P ＜0.01)，見圖2。

3 QUE 對細胞內(nèi)ROS 和培養(yǎng)液MDA 水平的影響

ox-LDL 組細胞內(nèi)ROS 和培養(yǎng)液中MDA 含量均明顯升高，與正常對照組比較差異有統(tǒng)計學(xué)意義(P＜0.01);而與ox-LDL 組比較，QUE 預(yù)處理組ROS和MDA 含量均顯著降低，尤以80 μmol/L QUE 組更為明顯(P ＜0.01)，見圖3。

Figure 2. Suppressive effect of QUE on ox-LDL-induced LDH release in macrophages. Mean±SD. n=6. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs ox-LDL group.圖2 QUE 降低ox-LDL 所致的細胞LDH 釋放

Figure 3. Effects of QUE on the levels of intracellular ROS (A)and MDA in culture medium (B). Cells were pretreated with 20，40 and 80 μmol/L of QUE for 30 min and then treated with ox-LDL (100 mg/L)for 24 h.Mean±SD. n=6. * P ＜0.05，＊＊P ＜0.01 vs control group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs ox-LDL group.圖3 QUE 對細胞內(nèi)ROS 和培養(yǎng)液MDA 水平的影響

4 QUE 抑制ox-LDL 誘導(dǎo)的CD36 mRNA 和蛋白表達上調(diào)

QUE 明顯抑制ox-LDL 所誘導(dǎo)的CD36 mRNA 上調(diào)，且呈濃度依賴性(P ＜0.05 或P ＜0.01)，見圖4A。

免疫印跡結(jié)果顯示，與對照組比較，ox-LDL 處理組CD36 蛋白水平明顯增加;而給予20、40 和80 μmol/L QUE 預(yù)處理，CD36 較ox-LDL 處理組分別降低23. 1%、28. 5% 和45. 1% (P ＜0. 05 或P ＜0.01)，見圖4B。

討 論

Figure 4. Effects of QUE on CD36 expression in RAW264.7 cells. Cells were pretreated with 20，40 and 80 μmol/L of QUE for 30 min and then treated with ox-LDL (100 mg/L)for 24 h. The mRNA (A)and protein (B)levels of CD36 were analyzed by realtime PCR and Western blotting，respectively. Mean±SD. n = 4. * P ＜0. 05，＊＊P ＜0.01 vs control group;#P ＜0.05，##P ＜0.01 vs ox-LDL group.圖4 QUE 對CD36 表達的影響

AS 是一種由內(nèi)皮細胞、平滑肌細胞、單核/巨噬細胞等多種細胞參與的慢性炎癥反應(yīng)，而ox-LDL 是公認的誘導(dǎo)血管壁炎癥反應(yīng)的重要危險因素，在AS發(fā)生發(fā)展過程中起著重要作用。ox-LDL 與正常LDL主要區(qū)別在于其中的氧化成分，如氧化膽固醇組分等。單核細胞來源的巨噬細胞大量攝取ox-LDL 進而形成泡沫細胞，甚至死亡崩解，形成粥樣斑塊的脂質(zhì)核心，其主要原因是由于ox-LDL 中的氧化成分對巨噬細胞的氧化損傷［7］。本實驗結(jié)果顯示，給予ox-LDL 處理細胞24 h，巨噬細胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積顯著，ROS水平和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA 明顯增加，且反映細胞損傷的LDH 釋放明顯增多，表明巨噬細胞損傷與ox-LDL 引起的脂質(zhì)過氧化有關(guān)。因此增強單核/巨噬細胞抗氧化損傷能力可能對AS 疾病的防治具有重要意義。

QUE 又名五羥黃酮、槲皮酮，在植物界分布廣泛，具有抗氧化、降血脂、降血壓、增加冠脈血流量、減少毛細血管脆性、抗菌消炎等多種生物活性［3-4］。Kawai 等［8］檢測動脈壁中槲皮素代謝產(chǎn)物——槲皮素葡糖苷酸的分布，結(jié)果顯示其主要分布于粥樣病變處，且以巨噬細胞源性泡沫細胞中更甚，提示巨噬細胞可能作為槲皮素抗AS 的治療靶點。文獻報道［9］和我們既往研究［10］表明QUE 可增強小鼠巨噬細胞的抗氧化能力，抑制脂多糖所誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，并減輕毒胡蘿卜素所致巨噬細胞損傷。本實驗結(jié)果顯示，QUE 可抑制ox-LDL 所誘導(dǎo)的細胞LDH釋放，并減少ROS 和脂質(zhì)過氧化產(chǎn)物MDA 的生成，表明QUE 可減輕ox-LDL 所誘導(dǎo)的巨噬細胞脂質(zhì)過氧化損傷。

由清道夫受體介導(dǎo)的對ox-LDL 無限制攝取是泡沫細胞形成和AS 發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵，其中B 類清道夫受體CD36 是巨噬細胞表面主要識別、內(nèi)吞ox-LDL 的清道夫受體，其結(jié)合和攝取的ox-LDL 占巨噬細胞結(jié)合和攝取修飾脂質(zhì)的50%以上［2］。研究表明由ox-LDL 啟動的CD36 依賴性信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑可能為泡沫細胞形成所必需［11-12］。本課題組既往研究證實，QUE 可通過上調(diào)三磷酸腺苷結(jié)合盒式轉(zhuǎn)運體A1表達抑制泡沫細胞形成［13］。本實驗進一步探討了QUE 對CD36 表達的調(diào)控作用，結(jié)果顯示QUE 可明顯抑制巨噬源性泡沫細胞形成和細胞內(nèi)脂質(zhì)蓄積，并在mRNA 和蛋白水平均可抑制ox-LDL 所誘導(dǎo)的CD36 表達上調(diào)。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)QUE 可減輕ox-LDL 所誘導(dǎo)的RAW264.7 巨噬細胞脂質(zhì)蓄積和脂質(zhì)過氧化損傷，其機制可能與下調(diào)CD36 表達有關(guān)，而關(guān)于QUE對CD36 表達調(diào)控的上游分子機制仍有待進一步研究。

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