趙麗霞，馬洪濱，李春祥，洪紹彩，孟慶蓮，貝俊杰，高全勝

骨髓間充質干細胞移植（b o n e m a r r o w mesenchymal stem cells，BMSCs）是再生醫(yī)學領域研究的新進展。近年來，許多研究觀察到BMSCs移植對心肌梗死（myocardial infarction，MI）后心功能、心肌重塑有較好的改善作用，為心力衰竭（heart failure，HF）的治療提供了新的治療方法[1,2]。

1 材料與方法

1.1 實驗動物 43只（8～l0）周齡Wistar大鼠，體重（200～250）g（由中國人民解放軍軍事醫(yī)學科學院實驗動物中心提供）。室溫（18～25）℃，濕度45%～65%，氨濃度＜20mg/L，給光7am～7pm，普通飼料，自由飲水。分對照組（14只），MI組（14只），BMSCs移植組（BMSCs組，15只）。

1.2 缺血/再灌注動物模型建立 大鼠以40 mg/kg戊巴比妥鈉麻醉后，腹腔內注射阿托品2 mg/kg，呼吸機輔助呼吸，消毒后胸骨左緣（1～2）mm處剪斷第4肋骨，在（2～3）mm處將縫合針自左心室側穿入約（1/3～1/2）層心肌，連同結扎置入的1cm軟膠棒（直徑為3mm）及心肌后關閉胸腔。冠狀動脈結扎60min后開胸剪斷結扎線，逐層縫合肌肉、皮下組織及皮膚[3]。

1.3 骨髓間充質干細胞的原代培養(yǎng) 4周齡雄性Wistar大鼠(100-120g)斷頸處死，無菌狀態(tài)下暴露出股骨、脛骨干骺端骨髓腔，用不完全的DMEM/F12（Invitrogen公司）培養(yǎng)基約5 mL沖洗骨髓腔至中空，收集沖洗液15 kr/min離心10min，棄去上清，以10%完全DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細胞。計數活細胞后，調整活細胞的濃度為（1～5）×107/cm ，接種至25cm培養(yǎng)瓶中，37.5%CO2、95%濕度的細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)；分別于24 h、48 h換半量、全量培養(yǎng)基，棄去未貼壁懸浮的細胞，以后每3天換半量培養(yǎng)基，待細胞匯合至70%～80%，棄去培養(yǎng)基，用不完全DMEM/F12培養(yǎng)基沖洗后，加入0.25%的胰蛋白酶消化貼壁細胞，鏡下可見細胞變圓，部分脫壁，停止消化，吹打使所有細胞脫壁，15 kr/min離心細胞懸液；棄去上清，以15%完全DMEM/F12培養(yǎng)基重懸細胞，調整細胞濃度到1×106/cm，按1:1或1:2比例傳代培養(yǎng)[4]。

1.4 骨髓間充質干細胞心臟移植 心肌再灌注前在左心室前壁MI周邊5點注射，MI對照組注射不完全DMEM/F12培養(yǎng)基100μL；MSC組注射BMSC1×1010/L，每只100μL。

1.5 血流動力學檢測 大鼠分別于術后7d、28d血流動力學的檢測，2%戊巴比妥鈉（40 mg/kg）腹腔內麻醉，分離右頸總動脈，將充滿1%肝素的聚乙烯管（內徑0.5mm，外徑1 mm）經右頸總動脈逆行插入至左心室，另一端連接至MP150 16導生理記錄儀記錄左室收縮壓（LVSP）、左室舒張末壓（LVEDP）、左室內壓上升、下降的最大速率（±dp/dtmax）。

1.6 心肌組織圖像分析 術后7d和28d分別處死大鼠進行組織學分析。在10倍視野下，應用Image Pro Plus 4.5圖像分析軟件測定。①隨機選取5～6個完全包含梗死區(qū)自心內膜至心外膜的區(qū)域，計算其平均厚度；②梗死范圍的計算：梗死范圍＝（梗死區(qū)心內膜長度＋梗死區(qū)心外膜長度）/（左心室心內膜周長＋左心室心外膜周長）；③擴展指數的計算：擴展指數＝（左室心腔面積/左室面積）×（室間隔厚度/梗死區(qū)厚度）；④膠原分析：膠原容積分數（Collagen Volume Fraction，CVF）＝膠原總面積/圖像總像素數，代表膠原在所測組織中的相對含量；膠原成熟程度=（紅色膠原總面積+橙色膠原總面積）/（黃色膠原總面積+綠色膠原總面積）；⑤NET免疫組織化學檢測。

1.7 統計學方法 應用SPSS16.0處理，計量資料以 （±s）表示，符合正態(tài)分布的計量資料采用單因素方差分析及t檢驗，方差齊時組間兩兩比較采用LSD 法，方差不齊時采用Games-Howell 法。P＜0.05為差異有統計學意義。

2 結果

2.1 各組模型大鼠術后體重、心臟重量變化 各組大鼠術后7d、28d處死，體重、心室重量變化無統計學意義（表1）。

2.2 血流動力學指標 術后第7天與第28天，對照組、MI組、BMSCs組三組間大鼠LVSP無統計學差異（P＞0.05）；與對照組比較，MI組、BMSCs組LVEDP增高（P＜0.05），與MI組比較，BMSCs組降低（P＜0.05）；與對照組比較，MI組、BMSCs組左心室內壓力+dp/dtmax及-dp/dtmax降低（P＜0.05）；但BMSCs組+dp/dtmax及-dp/dtmax較MI組增加（P＜0.05，表2）。

2.3 心肌組織病理學分析

2.3.1心肌梗死面積及心室重塑 左室橫斷面苦味酸-天狼猩紅染色大體觀（圖1）：在鏡下可觀察MI組7天時梗死面積約30%，28天約26%，多為透壁性梗死，累及室壁厚度超過50%，BMSCs組7天的梗死面積約23%，28天約17%，梗死范圍往往只限于中層心肌，心內膜下和心外膜下均可見島狀存活心?。ū?）。

2.3.2 心肌梗死區(qū)膠原成熟度比較 與MI組比較，①CVF變化：術后第7天，MI區(qū)與非MI區(qū)MSCs組CVF差異無顯著性（P＞0.05）；術后第28天，BMSCs組MI區(qū)、非MI區(qū)CVF降低（P＜0.05）；②膠原成熟度：術后第7天，MI區(qū)與非MI區(qū)BMSCs移植組膠原成熟度無明顯變化（P＞0.05）；術后第28天，MI區(qū)與非MI區(qū)MSCs組成熟程度降低（P＜0.05，表4）。

2.3.3 心肌NET免疫組織化學檢測 術后第7天，與對照組相比，MI組與MSCs組心肌NET蛋白均增高（P＜0.05），術后第28天NET表達均低于第7天，MSCs組仍高于對照組和MI組（P＜0.05）（表5，圖2）。

3 討論

心肌梗死（MI）后，由于成熟的心肌細胞缺乏再生能力，心肌細胞的喪失和病理性心室重構是發(fā)展為心功能不全的主要成因。而在心梗時心臟交感神經變化目前已引起了重視，包括神經支配密度和神經再攝取功能的改變。

心肌梗死后出現心臟交感神經變化（neuroplasticity），包括神經密度降低、不均勻分布(heterogeneous innervation)、神經再生（regeneration）及神經再攝取功能（reuptake 1）異常等，這些變化常同時存在。無論是否同時存在神經密度變化，甚至神經密度增加，均可出現神經攝取功能降低[8-13]。正常情況下，交感神經釋放的NE 90%以上由神經突觸前膜上的去甲腎上腺素轉運蛋白（NET）重新攝取回到突觸前膜中[14,15]。交感神經功能異常，神經再攝取作用下降，導致心肌間質中NE水平長期增高是導致HF進展的重要原因。

表1 各組大鼠體重及左心室體重比變化情況

表2 各組大鼠超聲血流動力學檢測情況

表3 左心室梗死范圍、厚度及膨展指數

圖1 左心室橫斷面（苦味酸-天狼猩紅染色，×10；A：假手術組，B：MI對照組MI后7d，C：MI對照組MI后28d，D：MSC組MI后7d，E：MSC組MI后28d）。

圖2 NET免疫組化標本（伊紅染色，×200）；箭頭所示為NET蛋白

表4 左心室梗死區(qū)、非梗死區(qū)膠原成熟度、容積分數

表5 大鼠非梗死區(qū)去甲腎上腺素轉運蛋白陽性數

眾所周知，心肌間質即細胞外基質（ECM）的主要成分是膠原，而膠原中又以I型和Ⅲ型膠原為主，約占心肌膠原總量90%以上，這些物質對維持相鄰心肌細胞構成完整的功能單位起著重要的作用[5-7]。MI區(qū)膠原形成替代了壞死的心肌細胞有助于維持心臟的幾何形態(tài)，而MI區(qū)和非MI區(qū)的膠原則過度增生并且結構紊亂，導致纖維化，進而心臟重塑損害心臟的功能。心臟重塑除了纖維化以外，還有心肌細胞的凋亡、肥大，由于非MI區(qū)不存在組織的缺損，因此非MI區(qū)對心臟重塑的貢獻主要體現在心肌細胞的凋亡、肥大。

本實驗中MSCs組的膠原成熟度比MI組低，不成熟膠原較多，這一變化抑制心室腔的進行性擴張，延緩心室重構的進展。既往研究已經發(fā)現，交感神經對膠原生成可能存在著一定的關系。El-Helou等也觀察到[16]，與對照組比較，糖皮質激素（地塞米松）干預可使MI后非MI區(qū)心肌膠原（myocardial collagen）mRNA 顯著降低，同時心肌交感神經密度、生長相關蛋白43（growth associated protein 43，GAP43）、NGFmRNA及蛋白表達均下降。說明抑制膠原合成，可降低交感神經支配密度，但這個影響可能不是直接的，被很多復雜的機制所掩蓋。有研究發(fā)現，通過不同途徑阻斷交感神經興奮，均可減少心肌梗死大鼠模型的心臟膠原沉積，提示交感神經系統過度激活在誘導心肌肥厚的同時，亦參與了心梗后心臟膠原重塑的發(fā)生、發(fā)展。這提示神經因素對心臟重塑是有一定影響的[17]。研究顯示，MI后發(fā)生改變的物質可影響神經因素、膠原重塑：①血管緊張素（Ang）—交感神經參與激活局部組織腎素-血管緊張素系統[18]催化AngI轉化為AngⅡ，AngⅡ與特異性受體AT1結合通過絲裂原激活蛋白激酶/胞外信號調節(jié)激酶（IVIAPK/ERK）途徑促進膠原合成[19]；②蛋白激酶C（PKC）—機械壓力的變化和AngⅡ可以激活PKC，從而影響基質金屬蛋白酶家族等調控膠原的物質[20,21]，同時，PKC還可以介導突觸前膜上表面表達的NET發(fā)生內化，從而使NET表面表達數量減少[22,23]，間接升高NE加重對組織重構的影響[24]；③神經肽—交感神經的異常增生可能過度釋放神經肽，從而致神經肽的積累，即使在沒有機械應力的作用下，仍然能導致膠原的形成[25]。

本實驗結果表明，交感神經再生與膠原含量二者間關系密切，調控交感神經功能或影響膠原合成的因素可能互相影響，確切機制需要進一步研究。心肌間質、交感神經功能異常對MI后心臟重塑均有重要影響，闡明二者間互相影響機制對治療心血管病后心臟重塑及對心功能不良影響意義重要。

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