丁超，郭潔，王冬梅，李潔，陳會校，孫家安

經(jīng)皮冠狀動脈介入治療（PCI）技術帶來的再灌注損傷，直接影響到患者的預后，特別是再灌注心律失常，是缺血再灌注期間患者猝死的最主要原因之一[1]。重組人腦鈉肽（rhBNP）能夠拮抗腎素－血管緊張素系統(tǒng)（RAS）和交感神經(jīng)系統(tǒng)的激活，抑制心肌重塑[2,3]。

本研究采用全細胞膜片鉗技術，研究rhBNP對缺血再灌注后兔心室肌細胞跨膜L－鈣通道電流（ICa-L）的影響，探討rhBNP拮抗再灌注心律失常的細胞學離子機制。

1 材料與方法

1.1 實驗動物與分組 健康新西蘭大耳白兔45只，雌雄不限，體重（2～2.5）Kg，由河北醫(yī)科大學實驗動物中心提供。隨機分為3組（每組15只）：缺血再灌注組（I-R組），rhBNP治療組（rhBNP組）和假手術對照組。

1.2 實驗藥物與溶液 實驗藥物：HEPES, EGTA, 4-aminopyridine（4-AP）, 膠原酶Ⅰ，氯化膽堿購自Sigama公司，余試劑均為國產(chǎn)分析純。rhBNP（新活素，0.5mg/支，由成都諾迪康生物制藥有限公司生產(chǎn)）。溶液：ICa-L電極外液：氯化膽堿 120 mmol/L，CsOH 4 mmol/L，CaCl21.8 mmol/L，MgCl22 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，Glucose 10 mmol/L，用CsOH調節(jié)pH至7.3。加入4-AP 5 mmol/L、CsCl 20 mmol/L以阻斷鉀電流。ICa-L電極內(nèi)液：CsCl 80 mmol/L，MgCl22 mmol/L，ATPNa2 5 mmol/L，HEPES 10 mmol/L，EGTA 10 mmol/L，用CsOH調節(jié)pH至7.3。

1.3 心肌缺血再灌注動物模型建立 采用2.5%硫噴妥鈉1.0ml/kg耳緣靜脈麻醉，利用針刺電極插入動物四肢皮下記錄肢導心電圖。剪開心包膜后，在左心耳下2mm，分離左冠狀動脈前降支，用3/8圓2.5×8mm不銹鋼圓針，帶6-0絲線穿過心肌淺層，絲線穿過一塑料管，拉緊塑料管兩端絲線，使塑料管壓迫冠狀動脈造成心肌缺血，30 min后，放松結扎線后行心肌再灌注120 min。其中假手術對照組開胸后僅分離左冠狀動脈前降支并穿線而不結扎，以排除開胸手術對心肌細胞電生理參數(shù)的影響。在缺血再灌注模型開始后，rhBNP組動物耳緣靜脈注射rhBNP 0.06μg/（kg.min）（持續(xù)30 min），I-R組和對照組動物由耳緣靜脈注射相同劑量的生理鹽水。

1.4 心律失常評分標準 采用心電監(jiān)護儀進行監(jiān)測。心律失常診斷標準按照Lambeth會議標準，評分則采用Curtis-Walker評分規(guī)則[4]，對心律失常嚴重程度進行定量分析。具體如下：①0分：無心律失常；②1分：偶發(fā)性室性早搏（指1min內(nèi)發(fā)生3次以下的室性早搏）；③2分：頻發(fā)性室性早搏（指1min內(nèi)發(fā)生3次或3次以上的室性早搏）；④3分：偶發(fā)性室速（指1min內(nèi)發(fā)生3次以下的室速）；⑤4分：頻發(fā)性室速（指1min內(nèi)發(fā)生3次或3次以上的室速）或偶發(fā)性室顫（指1min內(nèi)發(fā)生3次以下的室顫）；⑥5分：頻發(fā)性室顫（指1min內(nèi)發(fā)生3次或3次以上的室顫）或死亡。

1.5 細胞分離 采用酶解（膠原酶I 0.4mg/ml，Sigma公司）的方法分離單個心室肌細胞[5]。細胞來源于心臟冠狀動脈左前降支毗鄰的左心室前壁梗死區(qū)部位，特征為此梗死區(qū)外膜變?yōu)榘咨咂瑺?；對照組細胞則取自左心室前壁與梗死區(qū)相對應的部位。

1.6 膜片鉗全細胞記錄 按Hamill法[6]進行，脈沖信號由pulse+pulsefit軟件（HEKA，version 8.53）控制，通道信號經(jīng)EPC-9膜片鉗放大器（HEKA，德國）放大，通過Ag-AgCl電極絲和填充電極內(nèi)液的微電極導入細胞，產(chǎn)生的電流信號經(jīng)EPC-9轉換，為pulse+pulsefit軟件收集、分析。各電流幅值除以細胞膜電容所得即為電流密度，以不同鉗制電壓下的電流密度繪成電流—電壓關系（I-V）曲線。所有實驗在室溫（25℃）下進行。

2 結果

2.1 rhBNP對缺血再灌注中心律失常的影響 對照組僅出現(xiàn)偶發(fā)室性早搏，I-R組室速和室顫發(fā)生率明顯增加，心律失常評分明顯增加（P＜0.01）；與I-R組相比，rhBNP組室速和室顫發(fā)生率下降，心律失常評分降低（P ＜0.05）。

2.2 rhBNP對缺血再灌注后心肌細胞ICa-L的影響 從維持電位（Holding potential，HP）-50 mV開始，階躍+10 mV，逐步去極化到+40 mV，時程250 ms。以不同鉗制電壓下的ICa-L電流強度繪成I-V曲線。均在-40 mV激活，0 mV達峰值，+50 mV時反轉。I-R組與對照組相比，I-V曲線上移；rhBNP組與I-R組相比，I-V曲線下移，接近對照組。但ICa-L電壓依賴性不變，對激活電位、峰值電位、反轉電位及I-V曲線的形態(tài)軌跡均無影響（圖1）。

表1 三組心律失常的發(fā)生情況及心律失常評分

圖1 rhBNP對缺血心肌細胞ICa-LI-V曲線的影響

3 討論

再灌注心律失常是指缺血心肌的部分或全部在血流灌注恢復的過程中所發(fā)生的心律失常，進而導致患者血液動力學改變，是缺血再灌注期患者猝死的重要原因之一，約占80%[1]?？剐穆墒СＫ幬飩鹘y(tǒng)作用靶點是直接阻斷某一離子通道，但這些藥物對病變心臟的室性快速心律失常的療效不佳且有負性效應，特別是心律失常抑制試驗（CAST）中，應用鈉通道阻斷劑氟卡胺及恩卡胺治療急性心肌梗死（AMI）后室性心律失常，增加了死亡率，引發(fā)了對傳統(tǒng)抗心律失常藥物致心律失常副作用的擔憂。

腦鈉肽（BNP）是一種主要由心室肌分泌的激素，國外基礎及臨床研究結果表明，BNP可擴張機體動靜脈血管，降低肺及外周血管阻力，提高心輸出量，降低容量負荷，并可拮抗繼發(fā)性的RAS系統(tǒng)和交感神經(jīng)系統(tǒng)的激活[2,7]，對抗毒性作用，減少心肌梗死面積[8]，改善患者的臨床和血液動力學指標[9]。rhBNP是一種應用生物重組技術生產(chǎn)的、與人類內(nèi)源性BNP等同的肽類物質，已在2001年被美國食品及藥品管理署（FDA）批準應用于臨床治療急性失代償性心衰。

再灌注心律失常的發(fā)生機理尚不完全明確，鈣超載可能是原因之一。本研究發(fā)現(xiàn)，rhBNP可降低心肌缺血再灌注期間心律失常的發(fā)生率。心肌缺血再灌注后，ICa-L明顯增高，rhBNP可使上升的ICa-L下調，逆轉電重構，可能為rhBNP降低心律失常發(fā)生率的細胞學離子機制。rhBNP可能通過兩條途徑發(fā)揮抗心律失常作用：一方面通過鈣拮抗作用，提高室顫閾，增加細胞膜的穩(wěn)定性；另一方面通過拮抗RAS系統(tǒng)和內(nèi)皮素活性、抑制交感神經(jīng)興奮性，改善血液動力學指標，修復心室肌細胞離子通道的損傷而發(fā)揮抗心律失常作用。心肌細胞膜上的離子通道本來是有序的，病變心肌多離子通道的改變使動作電位縮短或延長，導致心律失常。由于動作電位的長度與膜復極化過程總的離子流相關，單純阻斷某一離子通道的藥物難以發(fā)揮理想的作用。所以，有效的抗心律失常藥物的新靶點應以降低離子通道的損傷為楔入點，改變離子通道的環(huán)境尤為重要。

[1] Mehta D,Curwin J,Gomes JA,et al. Sudden death in coronary artery disease: acute ischemia versus myocardial substrate[J]. Circulation,1997,96(9):3215-23.

[2] Jensen KT,Carstens J,Pedersen EB. Effect of BNP on renal hemodynamics,tubular function and vasoactive hormones in humans[J]. Am J Physiol,1998,274(Suppl):F63-72.

[3] D'Souza SP,Yellon DM,Martin C,et al. B-type natriuretic peptide limits infarct size in rat isolated hearts via KATP channel opening[J]. Am J Physiol Heart Circ Physiol,2003,284(5):H1592-600.

[4] Curtis MJ,Walker MJ. Quantification of arrhythmias using scoring systems:an examination of seven scores in an in vivo model of regional myocardial ischaemia[J]. Cardiovasc Res,1988,22(9):656-65.

[5] Ding C,FU XH,He ZS,et al. Effects of simvastatin on ion channel currents in ventricular myocytes from acute infarcted heart of normocholeterolemic rabbits[J]. South China Journal of Cardiology,2008,9(3):150-4.

[6] Hamill OP,Marty A,Neher E,et al. Improved patch-clamp teachniques for high -resolution current recording from cells and cell-free membrane patches[J]. Pflugers Arch,1981,391(2):85-100.

[7] Peacock WF,Emerman CL,young J. Nesiritide in congestive heart failure associated with acute coronary syndromes:a pilot study of safety and efficacy[J]. J Card Fail, 2004,10(2):120-5.

[8] Burley DS,Baxter GF. B-type natriuretic peptide at early reperfusion limits infarct size in the rat isolated heart[J]. Basic Res Cardiol,2007,102(6):529-41.

[9] Kousholt BS. Natriuretic peptides as therapy in cardiac ischaemia/reperfusion[J]. Dan Med J,2012,59(6):B4469.