王 瑋，趙方貴，侯麗霞，車永梅，劉 新

(青島農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東省高校植物生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，青島 266109)

叢枝菌根真菌(arbuscular mycorrhiza，AM)是一種古老的營專性活體寄生的土壤微生物，可以與陸地上80%的高等植物共生，并形成菌根［1］。業(yè)已證明AM真菌可以促進(jìn)植物對(duì)礦質(zhì)元素(如氮、磷、鉀等)的吸收［2-3］，改善植物的根際微環(huán)境［4］，提高植物的抗鹽和抗旱等抵御逆境的能力［5］，進(jìn)而促進(jìn)植物體的生長(zhǎng)。在AM真菌與植物的共生過程中有一系列信號(hào)分子的傳遞，其中Ca2+是AM真菌共生體的早期信號(hào)物質(zhì)［6］，由AM真菌分泌產(chǎn)生的菌根形成因子(Myc因子)［7］經(jīng)Ca2+信號(hào)的傳遞后，可誘導(dǎo)宿主合成和分泌諸多下游信號(hào)分子從而保證真菌隨后侵染宿主并在宿主的根內(nèi)延伸;宿主植物根部分泌類黃酮物質(zhì)可以啟動(dòng)菌根－宿主植物共生體中的一些蛋白質(zhì)的合成及一些其它化合物的分泌，刺激AM真菌孢子的萌發(fā)［8］。AM真菌與植物共生后還可以誘導(dǎo)植物根系中乙烯(ethylene，ETH)、水楊酸(salicylic acid，SA)、茉莉酸(jasmonic acid，JA)和過氧化氫(H2O2)等信號(hào)分子產(chǎn)生［9-10］;Fester和 Hause［11］利用二氨基聯(lián)苯胺(diaminobenzidine，DAB)等 3 種不同染色手段在被根內(nèi)球囊霉(Glomus intraradices)侵染的玉米、煙草和苜蓿的根部和菌絲中均檢測(cè)到H2O2。研究發(fā)現(xiàn)，AM真菌對(duì)由宿主根部所分泌的strigolactone(5-deoxy-strigol)能夠做出快速強(qiáng)烈的反應(yīng)［12］，這說明在AM真菌與宿主植物根部之間存在有效的信號(hào)級(jí)聯(lián)放大系統(tǒng)。目前雖已得知AM真菌可以誘導(dǎo)宿主植物分泌和產(chǎn)生多種信號(hào)分子，但是AM真菌與宿主之間的信號(hào)分子的種類及其信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制還不甚很清楚。

一氧化氮(NO)是一種普遍存在于植物體內(nèi)的內(nèi)源性氣體信號(hào)分子［13］，參與了植物對(duì)氣孔運(yùn)動(dòng)［14］、逆境應(yīng)答［15］以及對(duì)植物生長(zhǎng)發(fā)育的調(diào)控［16］等多種生理過程。植物中NO的主要來源于硝酸還原酶(NR)途徑，植物中NR利用NAD(P)H作為電子供體，催化硝酸鹽轉(zhuǎn)變?yōu)閬喯跛猁}，促進(jìn)NO的生成［17］。有報(bào)道，NO專一性清除劑可以抑制萘乙酸對(duì)側(cè)根生長(zhǎng)的作用，說明NO可能作為信號(hào)分子參與生長(zhǎng)素誘導(dǎo)的側(cè)根生長(zhǎng)過程［18］。AM真菌與宿主植物共生后能夠促進(jìn)宿主根系的延伸，吸收更多的營養(yǎng)物質(zhì)，NO是否也作為信號(hào)分子參與共生過程，目前尚未見報(bào)道。

本實(shí)驗(yàn)以煙草為材料，苗期接種G.m，通過檢測(cè)接種后煙草側(cè)根中NO的含量、NR的活性以及nia-1基因的表達(dá)量，側(cè)根和菌絲中NO的水平，以探究NO在AM真菌與煙草共生過程中的作用，為深入了解AM真菌與植物體共生的信號(hào)機(jī)制提供證據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

供試煙草(Nicotiana tabacum，品種為CF90NF)由中國煙草公司青島分公司提供。供試AM真菌為摩西球囊霉(Glomus mosseae，G.m)由青島農(nóng)業(yè)大學(xué)菌根技術(shù)實(shí)驗(yàn)室提供。AM真菌接種物為經(jīng)三葉草擴(kuò)繁后，含培養(yǎng)基質(zhì)、孢子、菌絲和侵染根段的混合物。

NO供體硝普鈉(sodium nitroprusside，SNP)、NO專一性熒光探針 DAF-2DA(4，5-diaminofluorescein diacetate，DAF-2 DA)、NO 清除劑 2-4，4，5，5-苯-四甲基咪唑-1-氧-3-氧化物(2-(4-carboxyphenyl)-4，4，5，5-tetramethylimidazoline-1-oxyl-3-oxidepotassium salt，cPTIO)、NR 抑制劑鎢酸鈉(sodium tungstate，Na2WO4)均購于Sigma公司(U.S.A);其余化學(xué)試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.2 材料處理

將煙草種子經(jīng)10%NaClO滅菌15 min，無菌水沖洗5次后，點(diǎn)種于含草炭土∶土∶河沙=2∶2∶1的滅菌基質(zhì)中，于25℃，16 h/8 h光周期，光強(qiáng)120—400μmol m－2s－1下培養(yǎng)。生長(zhǎng)4周后取生長(zhǎng)狀態(tài)一致的煙草苗，移栽至含滅菌河沙的小盆中(直徑×高=11.5 cm×8 cm)，同時(shí)接種AM真菌G.m(接種量為菌種∶基質(zhì)=1∶10)(對(duì)照為接種等量滅菌基質(zhì))。每?jī)商靽娛?/2Hoagland營養(yǎng)液。

在接種后的0、5、10、15、20和30d分別取煙草側(cè)根，用蒸餾水將根部基質(zhì)沖洗干凈，用于測(cè)定內(nèi)源的NO含量、NR活性、Nia-1基因表達(dá)量及側(cè)根中NO的熒光強(qiáng)度。在接種后的20、25、30d用Tennant的方法［19］獲得菌絲，用于NO的熒光檢測(cè)。

在接種后5d開始向煙草根部基質(zhì)中加入以下處理液:NO清除劑c-PTIO(2.0 mmol/L)、NO供體硝普鈉SNP(1.0 mmol/L)、NR抑制劑鎢酸鈉(1 mmol/L)，對(duì)照加入等量的1/2Hoagland營養(yǎng)液，分別在處理后10、15、20、25和30d取煙草側(cè)根用于檢測(cè)煙草側(cè)根的侵染率，并在20d時(shí)分別取側(cè)根和菌絲測(cè)定NO熒光強(qiáng)度。

1.3 方法

1.3.1 NO 含量和NR 活性的檢測(cè)

用NO試劑盒(南京建成生物工程研究所)測(cè)定NO含量。取0.1 g煙草側(cè)根加0.9%NaCl 0.9 mL，勻漿;12000×g離心10 min，取上清，沸水浴5 min;12000×g離心5 min，取上清，稀釋10倍用于檢測(cè)。在550 nm波長(zhǎng)下，測(cè)定吸光度值，按照試劑盒說明，計(jì)算出組織中的NO水平。

用NR試劑盒(南京建成生物工程研究所)測(cè)定NR活性。取煙草側(cè)根，洗凈，用濾紙吸干后，放入誘導(dǎo)劑應(yīng)用液中浸泡誘導(dǎo)2 h，取出用濾紙吸干，置于－20℃冷凍30 min后濾紙吸干并稱取0.2 g，按重量體積比加入1.8 mL勻漿介質(zhì)，冰浴研磨制成10%的勻漿液，4000 r/min離心10 min，取上清在550 nm波長(zhǎng)下，測(cè)定吸光度值，按照試劑盒說明，計(jì)算出組織中的NR活力。

1.3.2 NO 的熒光檢測(cè)

取不同處理的煙草側(cè)根和菌絲，加入DAF-2DA(20μmol/L)，25℃下避光孵育20 min，孵育完畢后用緩沖液沖洗，除去吸附的染料。將處理好的表皮條置于載玻片上，蓋好蓋片，用488 nm藍(lán)光激發(fā)，經(jīng)尼康(NikonTE2000)倒置熒光顯微鏡掃描獲得根細(xì)胞和菌絲中NO的靜態(tài)分布圖。

1.3.3 Nia-1的熒光實(shí)時(shí)定量PCR檢測(cè)

利用TriZol試劑盒提取煙草根系的總RNA，按照M-MLV反轉(zhuǎn)錄試劑盒說明書合成cDNA第1條鏈，作為模板，同時(shí)設(shè)立負(fù)對(duì)照。Real-time PCR的程序?yàn)?95℃ 5 min，95℃ 10 s，58℃ 10 s，72℃ 15 s，40個(gè)循環(huán);Melt曲線從72℃至99℃，第1步維持45 s，以后每升高1℃ 維持5 s。Nia-1的正向和反向引物序列分別為5'-AATCAGGTGGATGGATGGCGAAG-3'和5'-TTCGCCATCCATCCACCT-3'。β-actin的正向和反向引物序列分別為5'-GATGAGTTGGGTGTTGCTCCT-3'和5'-GAAGTCCTCGTTGTTGCGTTG-3'。用熔解曲線法檢測(cè)實(shí)時(shí)定量PCR產(chǎn)物的特異性，采用MyiQ software進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)

所有結(jié)果都是3次重復(fù)的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差。測(cè)定結(jié)果用DPS數(shù)據(jù)處理系統(tǒng)進(jìn)行方差分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 AM真菌對(duì)煙草側(cè)根和AM真菌NO的影響

2.1.1 AM真菌與煙草的共生過程煙草側(cè)根NO含量的變化

利用分光光度法和NO的特異性熒光探針DAF-2DA分別檢測(cè)了AM真菌與煙草共生過程中NO的變化。由圖1可知，煙草側(cè)根中含有一定水平的內(nèi)源NO，接種AM真菌后煙草側(cè)根中NO含量呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，在苗期接種后10d達(dá)到最大值(P＜0.05)，同時(shí)煙草側(cè)根中NO的熒光強(qiáng)度亦顯著增強(qiáng)(圖2A)。

cPTIO為NO清除劑，SNP為NO的供體，Na2WO4為的NO合成酶NR的抑制劑。為了進(jìn)一步研究NO在AM真菌與煙草共生過程中的作用，在NO猝發(fā)時(shí)分別觀測(cè)了NO清除劑、供體和合成酶抑制劑的作用。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，cPTIO和Na2WO4可以顯著降低NO的含量，而SNP使煙草側(cè)根中NO含量增加了71.2%(圖1)。由此推測(cè)，在AM真菌與煙草共生過程中的NO可能是由煙草側(cè)根產(chǎn)生的，且NR是NO的主要來源。

2.1.2 AM真菌與煙草的共生過程AM菌絲NO水平的變化

圖1 NO清除劑和抑制劑對(duì)AM真菌與煙草共生過程中煙草側(cè)根NO含量的影響Fig.1 The change in NO concentration in the lateral roots of tobacco symbiosis with Glomus mosseae after treatment with NO scavenger and inhibitor

為了進(jìn)一步探明AM真菌與煙草的共生過程N(yùn)O的來源，以DAF-2DA作為NO的特異性熒光探針，檢測(cè)了菌絲中NO水平的變化。由圖2B可以看出，在接種后20—30d時(shí)在菌絲中檢測(cè)到綠色熒光，且隨著接種時(shí)間的延長(zhǎng)，菌絲中熒光強(qiáng)度稍微增強(qiáng)。菌絲中NO變化的時(shí)間要遲于煙草側(cè)根NO的猝發(fā)(圖2A)，且NO的清除劑和抑制劑沒有明顯改變菌絲中的NO熒光強(qiáng)度，由此推測(cè)，AM真菌與煙草共生過程中NO主要由煙草側(cè)根產(chǎn)生，菌絲中可能存在其他來源的NO。

圖2 AM真菌與煙草共生過程中煙草側(cè)根和G.m菌絲中NO的熒光變化(標(biāo)尺=100μm)Fig.2 Localization of fluorescence due to nitric oxide in tobacco lateral roots and the hyphae of G.m after treatment with the NO-specific fluorophore DAF-2DA(Scale-bars=100μm)

2.2 AM真菌對(duì)煙草根系NR活性和基因表達(dá)的影響

圖3結(jié)果顯示，接種G.m后煙草側(cè)根中NR活性和Nia-1的表達(dá)量均呈現(xiàn)先升高后降低的趨勢(shì)，均于接種后10天活性達(dá)到最大值，該變化趨勢(shì)與NO含量(圖1)的變化趨勢(shì)基本一致。由此推斷，NR途徑參與AM真菌誘導(dǎo)的煙草側(cè)根中NO的合成。綜合圖1、圖2和圖3的結(jié)果，從生理和分子水平證明了來自NR途徑的NO參與AM真菌與煙草的共生過程。

圖3 AM真菌與煙草共生過程中煙草側(cè)根NR活性和Nia-1基因表達(dá)的變化Fig.3 The change in NR activity and Nia-1 gene relative expression level in the lateral roots of tobacco symbiosis with Glomus mosseae

2.3 NO清除劑和NR抑制劑對(duì)煙草AM真菌侵染率的影響

為了進(jìn)一步證明來自NR的NO參與AM真菌與煙草共生過程，觀測(cè)了NO清除劑和合成抑制劑對(duì)煙草AM真菌侵染率的影響。結(jié)果表明，NO的清除劑和抑制劑可以顯著降低AM真菌侵染率，在接種后30d時(shí)侵染率分別下降了38.4%和26.4%，而NO供體SNP卻使AM侵染率增加了9.1%(圖4)。同時(shí)，外施一定濃度的SNP能有效增加側(cè)根中的孢子數(shù)和菌絲的分布，NO的清除劑c-PTIO和NR抑制劑Na2WO4處理后煙草側(cè)根中孢子數(shù)和菌絲量有所減少(結(jié)果未顯示)。說明NO是AM真菌與煙草的共生過程的重要組分。

3 討論

植物與微生物共生是自然界中普遍存在的一種生物學(xué)現(xiàn)象，其中高等植物和叢枝菌根真菌共生形成的菌根與農(nóng)業(yè)生產(chǎn)和生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定性密切相關(guān)。AM真菌與植物之間的互利共生依賴于兩者之間的信號(hào)傳遞，AM真菌通過特異的信號(hào)識(shí)別宿主，然后侵染宿主并與之共生。業(yè)已證明，宿主根系分泌的類黃酮、獨(dú)腳金萌發(fā)素內(nèi)酯以及菌根因子、Ca2+、SA和JA等信號(hào)分子均參與了該共生過程［8-10］，但AM真菌與植物共生的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)機(jī)制的研究才剛起步。NO是一種普遍存在于植物體內(nèi)的、具有生物活性和信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)作用的內(nèi)源性氣體信號(hào)分子，它參與調(diào)節(jié)植物的許多生命活動(dòng)，而且作為防御反應(yīng)中的關(guān)鍵信使，參與了植物對(duì)外界環(huán)境脅迫的應(yīng)答［20］，但NO在植物與微生物互作過程中的作用鮮見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)綜合利用分光光度法、熒光檢測(cè)技術(shù)以及分子生物學(xué)等實(shí)驗(yàn)技術(shù)，結(jié)合藥理學(xué)實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了AM真菌侵染煙草過程中NO水平的變化，發(fā)現(xiàn)接種G.m后煙草側(cè)根中NO含量(圖1)和NO熒光強(qiáng)度(圖2A)均明顯增加，NO的清除劑能顯著降低側(cè)根中NO的水平(圖1)和熒光強(qiáng)度(圖2C)，但對(duì)菌絲中的熒光強(qiáng)度影響不顯著(圖2C);并且清除NO可以降低根系的侵染率(圖4)，表明NO在G.m與煙草共生的過程中發(fā)揮了重要作用，NO可能作為AM真菌與宿主互利共生的重要信號(hào)物質(zhì)。

植物體中的NO的合成主要酶途徑是NR，許多實(shí)驗(yàn)顯示該途徑產(chǎn)生的NO參與調(diào)控植物的生長(zhǎng)發(fā)育［16］;調(diào)節(jié)ABA誘導(dǎo)的擬南芥(Arabidopsis thaliana)氣孔關(guān)閉［17，21］;參與了馬鈴薯(Solanum tuberosum)對(duì)晚疫病菌(Phytophthora infestans)侵染的應(yīng)答反應(yīng)［22］、水分脅迫下玉米(Zea mays)葉片中NO的產(chǎn)生［15］以及其他非生物脅迫過程［23］。高等植物的 NR 由 nia 編碼，至今已經(jīng)在擬南芥［24］、菠菜(Spinacia oleracea)［25］、煙草［26］、番茄(Solanum lycopersicum)［27］等植物中克隆了nia或nia的cDNA。菜豆中存在兩個(gè)nia基因位點(diǎn)，niaR-1在根中表達(dá)，niaR-2在葉片中表達(dá)［28］。煙草中編碼NR的基因主要有Nia-1和Nia-2［29］。本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)(圖3)，接種G.m也可以誘導(dǎo)煙草根系NR基因Nia-1的表達(dá);同時(shí)苗期接種G.m后，煙草側(cè)根中的NR活性明顯升高。且NR的抑制劑鎢酸鈉可以大大降低AM真菌與煙草共生過程中NO的產(chǎn)生(圖1)、顯著減弱煙草側(cè)根中的NO熒光強(qiáng)度(圖2C)，但是對(duì)菌絲中的NO熒光變化沒有明顯影響;NR抑制劑也影響了AM真菌對(duì)煙草的侵染。由此推測(cè)，來自NR途徑的NO參與了AM真菌與煙草共生過程，且NO主要由煙草側(cè)根產(chǎn)生。

圖4 NO清除劑和NR抑制劑對(duì)AM真菌侵染率的影響Fig.4 The change in the colonization rate of tobacco by G.m after treatment with NO scavenger and inhibitor

本文首次為信號(hào)分子NO參與AM真菌與煙草的共生過程提供了生理學(xué)、細(xì)胞學(xué)和分子生物學(xué)的實(shí)驗(yàn)證據(jù)。今后尚可以篩選或構(gòu)建煙草NO過表達(dá)和缺失突變體為深入了解NO在AM真菌與植物共生過程中的作用提供遺傳學(xué)的依據(jù)。植物與微生物共生的過程非常復(fù)雜，在日本百脈根中發(fā)現(xiàn)有9個(gè)基因(LjSYMRK、LjCASTOR、LjPOLLUX、LjSYM3、LjSYM6、LjSYM15、LjSYM24、LjNUP133 和 LjNUP85)與真菌侵染有關(guān)［30］，而且已經(jīng)明確了這些基因編碼的蛋白質(zhì)的類型。這些基因是否與AM真菌與植物的互作有關(guān)?Ca2+是AM真菌識(shí)別宿主的早期信號(hào)物質(zhì)［6］，Myc因子［7］經(jīng)Ca2+信號(hào)的傳遞，可誘導(dǎo)宿主合成和分泌諸多信號(hào)分子;AM真菌與植物共生過程中是否還存在其他信號(hào)物質(zhì)，這些信號(hào)物質(zhì)與NO、Ca2+，H2O2的關(guān)系怎樣，它們之間是如何相互作用的，還有待進(jìn)一步研究。只有了解共生雙方的識(shí)別信號(hào)及共生體結(jié)構(gòu)的形成信號(hào)，才能解開AM真菌與宿主植物共生的謎團(tuán)。

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