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(1.大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 干部綜合科，遼寧 大連 116011；2.大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 心內(nèi)科，遼寧 大連 116011 )

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)

AOPP對(duì)ECV304細(xì)胞表達(dá)SDF-1α的影響及其可能的機(jī)制

魏明麗1,丁懷玉2,呂田1,李真1,于紅玖1,王梅1,馬裴裴1

(1.大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 干部綜合科，遼寧 大連 116011；2.大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第一醫(yī)院 心內(nèi)科，遼寧 大連 116011 )

目的觀察晚期氧化蛋白產(chǎn)物(advanced oxidation protein product，AOPP)對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α(stromal cell derived factor-1 α,SDF-1α)的影響，并探討其作用機(jī)制。方法ECV304細(xì)胞分別經(jīng)0,50,100,200 μmol/L AOPP處理后，用RT-PCR法檢測其SDF-1α mRNA的表達(dá)，觀察AOPP對(duì)ECV304細(xì)胞的SDF-1α表達(dá)的影響。ECV304細(xì)胞先經(jīng)NF-κB通路特異性阻斷劑BAY11-7082處理，再經(jīng)AOPP處理，用RT-PCR法檢測其SDF-1α mRNA的表達(dá)，觀察BAY11-7082對(duì)AOPP促ECV304 細(xì)胞SDF-1α mRNA 表達(dá)作用的影響。結(jié)果AOPP促進(jìn)ECV304 細(xì)胞SDF-1α mRNA 表達(dá)，并且隨AOPP濃度的升高，SDF-1α mRNA 的表達(dá)增加。對(duì)照組、AOPP 50 μmol/L組、AOPP 100 μmol/L組及AOPP 200 μmol/L組SDF-1α mRNA/GAPDH mRNA值分別為0.034±0.005、0.109±0.019、0.226±0.037及0.322±0.043，組間比較差異均有顯著性意義，P<0.05。BAY11-7082抑制AOPP促ECV304細(xì)胞SDF-1α mRNA 表達(dá)，兩組細(xì)胞SDF-1α mRNA/GAPDH mRNA值分別為0.256±0.035和0.322±0.043，P<0.05。結(jié)論AOPP可上調(diào)ECV304細(xì)胞表達(dá)SDF-1α，NF-κB通路可能是介導(dǎo)這一作用的重要途徑之一。

晚期氧化蛋白產(chǎn)物；基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α；NF-κB

晚期氧化蛋白產(chǎn)物(Advanced oxidation protein products，AOPP)[1]被認(rèn)為是體內(nèi)各種蛋白質(zhì)受到氧化損傷所生成的終末產(chǎn)物的總稱，是隨著慢性腎功能衰竭、動(dòng)脈粥樣硬化等氧化應(yīng)激相關(guān)疾病[2]的發(fā)生發(fā)展而聚集于患者血漿和組織中的一組性質(zhì)各異的分子?；|(zhì)細(xì)胞衍生因子1α(stromal cell derived factor-1α,SDF-1α)是由基質(zhì)細(xì)胞產(chǎn)生的一種趨化蛋白，將其歸為CXC亞家族， SDF-1α具有強(qiáng)大的趨化功能[3]。CXCR4是SDF-1α的特異性受體，在血細(xì)胞生成、腫瘤轉(zhuǎn)移及HIV感染等過程中起著重要作用。最近的研究表明SDF-1α/CXCR4 在動(dòng)脈粥樣硬化斑塊中高表達(dá)[4],且CXCR4 在動(dòng)脈粥樣硬化形成過程有關(guān)的主要細(xì)胞成分如單核細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、內(nèi)皮祖細(xì)胞、平滑肌祖細(xì)胞等中均有表達(dá),因此SDF-1α/CXCR4 與動(dòng)脈粥樣硬化的關(guān)系已經(jīng)引起重視。本研究旨在探討AOPP對(duì)內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)SDF-1α的影響。

1 材料和方法

1.1 細(xì)胞株

人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞株ECV304由大連醫(yī)科大學(xué)附屬第一醫(yī)院中心實(shí)驗(yàn)室提供。

1.2 主要藥品試劑

TAKARA RNA PCR Kit(AMV)Ver 3.0購自TAKARA公司； RPMI1640購自GIBCO 公司；胎牛血清購自杭州四季青生物技術(shù)公司；無內(nèi)毒素牛血清白蛋白(BSA)購自SIGMA公司。

1.3 細(xì)胞培養(yǎng)

ECV304細(xì)胞常規(guī)培養(yǎng)于37 ℃，5%CO2，濕潤的恒溫孵箱中，培養(yǎng)液為含有10%胎牛血清的RPMI1640培養(yǎng)基，取第3～5代用于實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)前，細(xì)胞均經(jīng)過12 h無血清培養(yǎng)。 加入BSA、0、50、100、200 μmol/L的AOPP處理24 h后觀察SDF-1α表達(dá)的改變。

1.4 AOPP-BSA的制備

以 0.01 mol/L PBS(pH 7.4)將 BSA 溶解至 200 mg/mL，將 NaOCl 溶液稀釋至0.2 mol/L(新鮮配制)，各取等量混合(即以 1∶60 摩爾比混合)，室溫孵育 30 min，轉(zhuǎn)移至透析袋內(nèi)，4 ℃對(duì) 0.01 mol/L PBS(pH 7.4)透析 24 h以去除 NaOCl，每 4～6 h更換透析液1次，按碘量法檢測透析液中的 NaOCl，直至透析液中無 NaOCl，得到AOPP-BSA，0.22 μm 硝酸纖維素膜過濾消毒，分裝后-70 ℃凍存。以紫外分光光度計(jì)法，于酸性條件下、340 nm 測定AOPP-BSA粗純品和對(duì)照 BSA 樣品中 AOPP 的濃度，以氯胺-T(碘化鉀存在時(shí)最大吸收波長為 340 nm)為標(biāo)準(zhǔn)品，實(shí)際測定的為 AOPP 對(duì)氯胺-T 的相對(duì)濃度[1]。空白管、標(biāo)準(zhǔn)管、測定管及對(duì)照管分別含 100 μL PBS、氯胺-T(0～100 μmol/L)、AOPP-HSA(PBS 1∶50 稀釋)及對(duì)照 BSA，各管加入 5 μL 1.16 mol/L 碘化鉀，靜置 2 min，再加入 10 μL醋酸，混勻后立即于 340 nm 測定吸光度。以氯胺-T 的濃度和吸光度制作標(biāo)準(zhǔn)曲線，從而查出測定和對(duì)照樣品中 AOPP 的相對(duì)濃度(μmol/L)。應(yīng)用細(xì)菌內(nèi)毒素(Lipopolysaccharide，LPS)定量測定系統(tǒng)(鱟試劑動(dòng)態(tài)濁度法)進(jìn)行檢測。

1.5 細(xì)胞分組及實(shí)驗(yàn)

實(shí)驗(yàn)一：分別將0,50,100,200 μmol/L AOPP處理后的ECV304細(xì)胞，加入Trizol 試劑提取細(xì)胞總RNA,并逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA,再對(duì)逆轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物進(jìn)行PCR 循環(huán)。其中0 μmol/L AOPP處理后的ECV304細(xì)胞組作為對(duì)照組。比較不同濃度的AOPP對(duì)ECV304 細(xì)胞SDF-1α mRNA 表達(dá)的影響。反應(yīng)條件：94 ℃預(yù)變性5 min后94 ℃變性30 s→58 ℃退火45 s→72 ℃延伸1 min，28個(gè)循環(huán)后，72 ℃延伸10 min。SDF-1α引物：Sense 5’-AAG CCC GTC AGC CTG AGC TAC-3’，Antisense 5’-AGT TAT CTA CAT CTT GAA CCT CT-3’，預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物全長495 bp。GAPDH(內(nèi)參)引物：Sense 5’-TCA CCA TCT TCC AGG AGC GAG-3’，Antisense 5’-TGT CGC TGT TGA AGT CAG AG-3’，預(yù)計(jì)擴(kuò)增產(chǎn)物全長697 bp。反應(yīng)結(jié)束后,反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行1.5% 瓊脂糖凝膠電泳,溴化乙錠染色,凝膠成像系統(tǒng)采集電泳結(jié)果，并應(yīng)用附帶軟件分析目標(biāo)條帶與內(nèi)參條帶吸光度值之比，進(jìn)行半定量PCR。

實(shí)驗(yàn)二：將ECV304 細(xì)胞分兩組,即抑制劑組與非抑制劑組。其中抑制劑組在含20 μmol/L NF-κB抑制劑BAY11-7082 的培養(yǎng)基孵育1 h,之后吸出上述培養(yǎng)基,以無血清培養(yǎng)基洗滌細(xì)胞1次,再加入含200 μmol/L AOPP的RPMI 1640 培養(yǎng)液孵育24 h,收集上清液。非抑制劑組直接加入含200 μmol/L AOPP 的RPMI 1640 培養(yǎng)液孵育24 h,收集上清液。按上述方法檢測兩組細(xì)胞SDF-1α mRNA表達(dá)情況。

1.6 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié) 果

2.1 AOPP 對(duì)ECV304 細(xì)胞SDF-1α mRNA 表達(dá)的影響

與對(duì)照組(AOPP濃度為 0 μmol/ L)比較,不同濃度的AOPP (50 μmol/ L,100 μmol/L,200 μmol/L)均升高SDF-1α mRNA 的表達(dá)(均有P<0.05)。并且隨AOPP濃度的增加，SDF-1α mRNA 的表達(dá)進(jìn)一步升高(圖1，表1)。

圖1 RT-PCR檢測ECV304細(xì)胞經(jīng)0、50、100、200 μmol/L的AOPP處理24 h后的擴(kuò)增產(chǎn)物電泳

Fig 1 SDF-1α -RT-PCR amplification product electrophoresis in ECV304 cells incubated with different concentrations of AOPP

表1不同濃度AOPP對(duì)SDF-1α表達(dá)的影響

Tab 1 The expression of SDF-1α was was up-regulated by AOPP in a concentration-dependent manner (n=6)

組別SDF-1αmRNA/GAPDHmRNA對(duì)照組0．034±0．005AOPP50μmol/L組0．109±0．019AOPP100μmol/L組0．226±0．037AOPP200μmol/L組0．322±0．043

各組間比較，均P<0.05

2.2 NF-κB通路阻斷劑BAY 11-7082抑制AOPP促ECV304 細(xì)胞SDF-1α mRNA 表達(dá)作用

抑制劑組細(xì)胞SDF-1α mRNA/GAPDH mRNA值明顯低于非抑制劑組細(xì)胞(分別為0.256±0.035和0.322±0.043，P<0.05)(圖2)。

圖2 兩組細(xì)胞擴(kuò)增產(chǎn)物電泳

3 討 論

動(dòng)脈粥樣硬化(atherosclerosis,As)被公認(rèn)為是一種復(fù)雜的慢性炎性病變,眾多的趨化因子、粘附分子及細(xì)胞因子參與其中[5]。血管內(nèi)皮細(xì)胞對(duì)于維持血管正常的生理狀態(tài)具有重要的意義，內(nèi)皮細(xì)胞的功能受到損害或被擾亂都可能影響動(dòng)脈粥樣硬化的發(fā)生發(fā)展[6]，內(nèi)皮細(xì)胞表達(dá)粘附分子并與單核細(xì)胞發(fā)生粘附是內(nèi)皮細(xì)胞功能受損而處于激活狀態(tài)的表現(xiàn)之一。基質(zhì)細(xì)胞衍生因子-1α(stromal cell-derived factor-1 alpha,SDF-1α)是一種強(qiáng)趨化因子,其對(duì)T細(xì)胞的趨化活性比單核細(xì)胞趨化蛋白1(monocyte chemoattractant protein-1,MCP-1)和巨噬細(xì)胞炎性蛋白1(macrophage inflammatory protein-1,MIP-1)高10倍,且SDF 1α能介導(dǎo)血液中的炎性細(xì)胞與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附及向內(nèi)膜下遷移。近來動(dòng)物水平的研究結(jié)果提示SDF-1α/CXCR4軸與動(dòng)脈粥樣硬化性疾病密切相關(guān)[3,7]。

AOPP是Witko-Sarsat 等[1]于1996年報(bào)道由尿毒癥血液透析(hemodialysis，HD)患者血漿中分離出的含有雙酪氨酸結(jié)構(gòu)的蛋白交聯(lián)產(chǎn)物，是體內(nèi)各種蛋白質(zhì)受到氧化損傷所生成的終末產(chǎn)物的總稱，是隨著慢性腎功能衰竭(chronic renal failure，CRF)、動(dòng)脈粥樣硬化(atheroscleosis，AS)等氧化應(yīng)激相關(guān)疾病的發(fā)生發(fā)展而聚集于患者血漿和組織中的一組性質(zhì)各異的分子。AOPP是通過氯化氧化反應(yīng)在氧化應(yīng)激過程由吞噬細(xì)胞激活生成的次氧酸或氯胺對(duì)血清白蛋白氧化作用生成的含雙酪氨酸的蛋白交連物。已知分葉核中性粒細(xì)胞和單核細(xì)胞在適宜的刺激下能夠產(chǎn)生呼吸爆發(fā),而后者可以導(dǎo)致高活性的活性氧(reactiveoxygen species,ROS)大量產(chǎn)生。在ROS的形成中,吞噬細(xì)胞具有在髓過氧化酶的作用下生成含氯氧化物能力。髓過氧化酶在氯離子存在的情況下,使過氧化氫生成次氯酸。次氯酸是吞噬細(xì)胞所產(chǎn)生的毒性最強(qiáng)和化學(xué)性質(zhì)最活潑的一類物質(zhì)，AOPP是氯氧化物和血漿蛋白之間的反應(yīng)產(chǎn)物。目前，一些實(shí)驗(yàn)結(jié)果提示AOPP通過氧化修飾LDL，形成的AOPP-LDL能顯著地活化單核/巨噬細(xì)胞，進(jìn)而促進(jìn)AS的發(fā)生發(fā)展。但是AOPP是否通過直接刺激其他粘附因子的表達(dá)，從而促進(jìn)單核細(xì)胞趨化，及其與內(nèi)皮細(xì)胞的粘附，加速AS的發(fā)生發(fā)展，目前，這方面的研究較少。

本實(shí)驗(yàn)在ECV304細(xì)胞中檢測到低水平的SDF-1α表達(dá)，但經(jīng)過AOPP處理后，SDF-1α的表達(dá)明顯上調(diào)，而且其上調(diào)的程度隨AOPP濃度的增加明顯提高。然而AOPP促進(jìn)ECV304細(xì)胞SDF-1α的表達(dá)機(jī)制仍然不清楚。 本實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AOPP促ECV304 細(xì)胞SDF-1αmRNA表達(dá)的作用可被NF-κB通路特異性阻斷劑BAY11-7082抑制，表明NF-κB通路可能是介導(dǎo)AOPP上調(diào)ECV304細(xì)胞表達(dá)SDF-1α這一作用的重要途徑之一。當(dāng)然，還有其他更多的機(jī)制參與其中[8-9]，尚需要進(jìn)一步深入的研究。

[1] Witko-Sarsat V,Friedlander M,Capeillere-Blandin C,et al. Advanced oxidation protein products as a novel marker of oxidative stress in uremia[J]. Kidney Int，1996， 49(5): 1304-1313.

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Effectsofadvancedoxidationproteinproductsonexpressionsofstromalcellderivedfactor-1αinECV304cellsandthepossiblemechanism

WEIMing-li1,DINGHuai-yu2,LVTian1,LIZhen1,YUHong-jiu1,WANGMei1,MAPei-pei1

(1.ComprehensiveDepartmentofCadres,theFirstAffiliatedHospitalofDalianMedicalUniversity,Dalian116011,China; 2.CardiovascularDepartment,theFirstAffiliatedHospitalofDalianMedicalUniversity,Dalian116011,China)

ObjectiveTo observe the effect of advanced oxidation protein product (AOPP) on the expression of SDF-1α in ECV304 cells，and to investigate the possible mechanism.MethodsSDF-1α mRNA expressions were revealed by RT-PCR respectively in ECV304 cells preincubated with different concentrations of AOPP. SDF-1α mRNA expression was revealed by RT-PCR in ECV304 cells preincubated with BAY11-7082 which was a inhibitor of NF-κB signal transduction pathway.ResultsSDF-1α expression was constitutionally detected in ECV304 cells and was up-regulated by AOPP in a concentration-dependent manner. The promoting effect of AOPP on the expression of SDF-1α in ECV304 cells could be inhibited by BAY11-7082.ConclusionAOPP could up-regulate SDF-1α expression in ECV304 cells by NF-κB signal transduction pathway.

advanced oxidation protein products; stromal cell derived factor-1α; NF-κB

10.11724/jdmu.2013.06.08

R54

A

1671-7295(2013)06-0543-04

魏明麗,丁懷玉,呂田,等. AOPP對(duì)ECV304細(xì)胞表達(dá)SDF-1α的影響及其可能的機(jī)制[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013,35(6):543-546.

魏明麗(1981-)，女，遼寧大連人，主治醫(yī)師，碩士。E-mail：wml810120@hotmail.com

丁懷玉，主治醫(yī)師。E-mail：dhy791211@hotmail.com

2013-08-28；

2013-10-30)