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(大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第二醫(yī)院 綜合介入科，遼寧 大連 116027)

基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)

肝細(xì)胞癌中BTG2基因的表達(dá)及其對肝細(xì)胞癌細(xì)胞增殖和凋亡影響的研究

吳杰,宋磊,趙丹懿,郭冰

(大連醫(yī)科大學(xué) 附屬第二醫(yī)院 綜合介入科，遼寧 大連 116027)

目的研究肝細(xì)胞癌中BTG2基因的表達(dá)以及BTG2基因?qū)Ω渭?xì)胞癌HepG2細(xì)胞增殖和凋亡的影響。方法熒光定量PCR測定47例肝細(xì)胞癌組織中BTG2基因的表達(dá)情況。構(gòu)建表達(dá)載體pcDNA-BTG2，轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞。轉(zhuǎn)染后，蛋白質(zhì)印跡法檢測轉(zhuǎn)染后BTG2蛋白的表達(dá)，MTT法測定細(xì)胞生長抑制率，雙標(biāo)流式細(xì)胞法檢測細(xì)胞凋亡率。結(jié)果與癌旁組織相比，BTG2 mRNA在肝細(xì)胞癌組織中表達(dá)明顯下調(diào)(P<0.01)。且BTG2的表達(dá)與肝細(xì)胞癌的分級(jí)相關(guān)，隨著分化程度的升高呈逐漸增加的趨勢，但與肝細(xì)胞癌的分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無關(guān)。轉(zhuǎn)染表達(dá)載體pcDNA-BTG2能夠顯著上調(diào)HepG2細(xì)胞中BTG2蛋白的表達(dá)，同時(shí)，細(xì)胞生長抑制率及凋亡率明顯增加(P<0.01)。結(jié)論在肝細(xì)胞癌中BTG2基因表達(dá)下調(diào)，其表達(dá)上調(diào)能夠抑制肝癌細(xì)胞增殖并促進(jìn)凋亡。

肝細(xì)胞癌；BTG2基因；HepG2細(xì)胞；增殖；凋亡

肝癌為中國常見惡性腫瘤之一，其惡性程度高，治療仍以手術(shù)為主，預(yù)后差，生存期短，按細(xì)胞分型可分為肝細(xì)胞癌、膽管細(xì)胞癌及混合型肝癌，其中最常見的為肝細(xì)胞癌[1]。筆者前期的芯片篩查發(fā)現(xiàn)，在肝細(xì)胞癌組織中B細(xì)胞轉(zhuǎn)位基因(B-cell translocation gene 2,BTG2)基因表達(dá)降低明顯。本研究擬應(yīng)用熒光定量PCR檢測BTG2基因在肝細(xì)胞癌中的表達(dá)，構(gòu)建表達(dá)載體pcDNA3.3-BTG2并轉(zhuǎn)染肝細(xì)胞癌HepG2細(xì)胞系，檢測轉(zhuǎn)染后BTG2蛋白的表達(dá)以及HepG2細(xì)胞的細(xì)胞抑制率和凋亡率，研究肝細(xì)胞癌與BTG2基因的相關(guān)性以及BTG2基因?qū)Ω渭?xì)胞癌HepG2細(xì)胞增殖和凋亡的影響。

1 材料和方法

1.1 材料和試劑

本研究選取2008—2012年大連醫(yī)科大學(xué)附屬第二醫(yī)院收治的肝惡性腫瘤患者共47例，均接受肝部分切除術(shù)治療。其中男性31例，女性16例；年齡45～66歲，平均年齡(58.1±4.1)歲；腫瘤經(jīng)病理鑒定診斷為肝細(xì)胞癌，所有患者術(shù)前均未接受放射和化學(xué)治療。人肝細(xì)胞癌HepG2細(xì)胞系來源于中國科學(xué)院上海生命科學(xué)研究院細(xì)胞資源中心，由本科室實(shí)驗(yàn)室保存。熒光定量PCR檢測試劑盒為TaKaRa公司產(chǎn)品，轉(zhuǎn)染試劑TransMessenger為Invitrogen公司產(chǎn)品，表達(dá)載體pcDNA3.3-BTG2由Invitrogen公司合成，BTG2多克隆抗體為Abcam公司產(chǎn)品，MTT購自Sigma公司，AnexinV-FITC凋亡檢測試劑盒為大連博瑞德公司產(chǎn)品。

1.2 熒光定量PCR

待檢測組織標(biāo)本經(jīng)液氮冷凍后粉碎，加入TRIZOL，提取總RNA并逆轉(zhuǎn)錄成cDNA。兩步法擴(kuò)增BTG2基因。Primer5軟件設(shè)計(jì)BTG2引物，上游為5'-GAACTGTTGCGTGCTTGA-3'，下游為5'-AACCTTGCTTGCTCCCTCT-3'。以GAPDH基因?yàn)閮?nèi)參，根據(jù)實(shí)驗(yàn)所獲Ct值對BTG2進(jìn)行相對定量分析，分析方法選用比較Ct值法(2-ΔΔCt法)。

1.3 細(xì)胞轉(zhuǎn)染

將HepG2細(xì)胞接種在6孔板中(5×104個(gè)細(xì)胞/孔)，培養(yǎng)24 h。1 mg的pcDNA3.3-BTG2或pcDNA3.3與試劑盒中的Enhanser R試劑混合，再與4 μL TransMessenger試劑混合，獲得的混合物加入900 μL無血清培養(yǎng)基后用于孵育待轉(zhuǎn)染的A549細(xì)胞，2 h后吸去培養(yǎng)基，PBS清洗2次，然后用正常培養(yǎng)基培養(yǎng)。

實(shí)驗(yàn)分組如下：空白組(C1)為HepG2細(xì)胞；陰性對照組(C2)為轉(zhuǎn)染pcDNA3.3的HepG2細(xì)胞；BTG2組(B)為轉(zhuǎn)染pcDNA3.3-BTG2的HepG2細(xì)胞。

1.4 蛋白質(zhì)印跡法

收集各組待測細(xì)胞，提取細(xì)胞漿蛋白，Bradford法進(jìn)行定量。蛋白樣品上樣后，經(jīng)SDS-PAGE電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉、抗體孵育、ECL發(fā)光和成像等步驟后獲得圖像結(jié)果。對圖像進(jìn)行分析，BTG2表達(dá)的相對值=BTG2條帶的灰度值/內(nèi)參蛋白GAPDH的灰度值。

1.5 MTT檢測細(xì)胞生長抑制率

收集各組待測細(xì)胞，制成細(xì)胞懸液(1～2×105/mL)，在96孔板中每孔注入200 μL細(xì)胞懸液，培養(yǎng)12 h。無血清培養(yǎng)基配制MTT試劑(5 mg/mL)，于每孔內(nèi)注入20 μL，培養(yǎng)4 h。棄去培養(yǎng)基，每孔內(nèi)注入0.2 mL DMSO，震蕩5 min后培養(yǎng)30 min。于490 nm波長處測定待測細(xì)胞的吸光度。

1.6 流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡率

收集各組待測細(xì)胞，PBS制成細(xì)胞懸液，4 ℃ 1 000 r/min離心1 min(離心機(jī)半徑13 cm)，PBS重懸，重復(fù)兩次，以PBS制成細(xì)胞懸液(5×106/mL)，加入10 μL AnnexinⅤ試劑后混勻，避光常溫孵育15 min，再加入5 μL的碘化丙錠(10 mg/L)。流式細(xì)胞儀進(jìn)行雙色熒光細(xì)胞流式計(jì)數(shù)。

1.7 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)以mean±SD表示，應(yīng)用SPSS18.0統(tǒng)計(jì)軟件對數(shù)據(jù)進(jìn)行處理。應(yīng)用單因素方差分析進(jìn)行多樣本比較，應(yīng)用t檢驗(yàn)進(jìn)行組間比較，以P<0.01為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 熒光定量PCR檢測BTG2 mRNA在肝細(xì)胞癌組織中的表達(dá)

熒光定量PCR結(jié)果經(jīng)比較Ct值法分析進(jìn)行相對定量，肝細(xì)胞癌組織和癌旁組織中的△Ct分別為4.235±0.238與3.161±0.266，ΔΔCt為1.074。肝細(xì)胞癌組織中BTG2 mRNA的表達(dá)明顯下調(diào)，為癌旁正常組織中BTG2 mRNA表達(dá)量的47.50% (P<0.01)。而且，BTG2的表達(dá)與肝細(xì)胞癌的分級(jí)相關(guān)，隨著分化程度的升高呈逐漸增加的趨勢，但與肝細(xì)胞癌的分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、遠(yuǎn)處轉(zhuǎn)移無關(guān)。

2.2 蛋白質(zhì)印跡法檢測RNA干擾后HepG2細(xì)胞中BTG2蛋白的表達(dá)

各組蛋白質(zhì)印跡法結(jié)果均呈現(xiàn)清晰條帶(圖1)。BTG2蛋白在3組細(xì)胞中的相對表達(dá)量分別為0.764±0.043、0.779±0.052和1.238±0.064?？瞻捉M和陰性對照組無明顯差異(P>0.05)，而與空白組相比，BTG2組細(xì)胞中BTG2蛋白的表達(dá)明顯上調(diào)(P<0.01)。

圖1 pcDNA3.3-BTG2轉(zhuǎn)染后HepG2細(xì)胞中BTG2蛋白的表達(dá)

Fig 1 The BTG2 protein expression of the pcDNA3.3-BTG2-transfected HEPG2 cells

2.3 MTT檢測細(xì)胞抑制率

3組細(xì)胞的OD490值分別為0.768±0.037、0.735±0.042和0.564±0.032。陰性對照組和BTG2沉默組的細(xì)胞抑制率分別為4.3%和26.6%，BTG2沉默組細(xì)胞的增殖抑制更為明顯(P<0.01)，差異有顯著性意義。

2.4 流式細(xì)胞儀分析細(xì)胞凋亡

3組細(xì)胞的凋亡率分別為(2.53±0.19)%、(2.68±0.16)%和(5.26±0.21)%(圖2)?？瞻缀完幮詫φ战M無明顯差異；與空白組相比，BTG2組的細(xì)胞凋亡率增加顯著(P<0.01)。

圖2 pcDNA3.3-BTG2轉(zhuǎn)染后HepG2細(xì)胞中的凋亡率

3 討 論

BTG2基因是抗增殖基因家族，即BTG/TOB家族的成員之一，是該家族中最早被發(fā)現(xiàn)的一個(gè)。人BTG2基因是1996年由成淋巴瘤細(xì)胞株的cDNA文庫克隆的，定位于1q32，有2個(gè)編碼外顯子，編碼的蛋白質(zhì)由158個(gè)氨基酸組成[2]。BTG2基因在正常組織中廣泛表達(dá)。BTG2蛋白能夠作為瞬時(shí)早期反應(yīng)蛋白，參與了細(xì)胞的分化、增殖、凋亡、DNA損傷修復(fù)以及對腫瘤細(xì)胞的抑制等多種生理和病理過程[3-4]。BTG2基因可被多種因素、多條途徑所激活和調(diào)節(jié)，且與p53和CREB等腫瘤相關(guān)基因具有密切的聯(lián)系，可能是一種新的抑癌基因[5-6]。

前期的芯片篩查提示BTG2基因在肝細(xì)胞癌組織中表達(dá)降低明顯，本研究通過熒光定量PCR檢測47例肝細(xì)胞癌及相應(yīng)癌旁組織中BTG2 mRNA的表達(dá)，以期明確BTG2基因是否在肝細(xì)胞癌中表達(dá)異常。表達(dá)結(jié)果分析顯示，相對于癌旁組織，肝細(xì)胞癌組織中BTG2 mRNA表達(dá)降低顯著，這證實(shí)了BTG2基因表達(dá)異常與肝細(xì)胞癌相關(guān)，BTG2基因可能在肝細(xì)胞癌的發(fā)生進(jìn)展中作為負(fù)性調(diào)節(jié)因素存在。有研究報(bào)道，BTG2基因在肺癌、胃癌和乳腺癌等惡性腫瘤表達(dá)亦顯著下調(diào)，提示BTG2基因在多種腫瘤中的作用機(jī)制相似，均作為腫瘤抑制基因發(fā)揮作用[7-9]。

為了明確BTG2基因在肝細(xì)胞癌中是否亦具有抑制腫瘤細(xì)胞過度增殖的作用，本研究將構(gòu)建好的表達(dá)載體pcDNA3.3-BTG2轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞，上調(diào)了BTG2蛋白的表達(dá)，隨后的細(xì)胞抑制率檢測證實(shí)了，BTG2基因高表達(dá)的HepG2細(xì)胞抑制率上調(diào)明顯。有研究表明，BTG2主要是通過作用于細(xì)胞周期基因來調(diào)控細(xì)胞周期，進(jìn)而發(fā)揮抑制細(xì)胞增殖的作用[10]。此外，BTG2基因高表達(dá)的HepG2細(xì)胞還顯示了較高的凋亡率，這與Zhang等[9]的研究結(jié)果一致，BTG2在乳腺癌MDA-MB-231細(xì)胞中亦能夠誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，并抑制細(xì)胞增殖。這表明BTG2基因能夠參與細(xì)胞凋亡的調(diào)控過程,具有潛在的誘導(dǎo)凋亡的作用。但其中的具體作用機(jī)制尚不清楚，尚需進(jìn)一步更加精細(xì)的實(shí)驗(yàn)研究來證實(shí)。

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ExpressionofBTG2geneinhepatocellularcarcinomaandtheinfluencetoproliferationandapoptosisinHepG2cell

WUJie,SONGLei,ZHAODan-yi,GUOBing

(DepartmentofInterventionalRadiology,theSecondAffiliatedHospitalofDalianMedicalUniversity,Dalian116027,China)

ObjectiveTo study the expression of BTG2 gene in hepatocellular carcinoma and the influence of BTG2 gene to proliferation and apoptosis in HepG2 cells.MethodsThe expression of BTG2 gene in 47 cases of hepatocellular carcinoma was detected with real-time PCR. The expression vector pcDNA3.3-BTG2 was constructed and transfected to HepG2 cells. Then,the expression of BTG2 protein was detected by western blot,and the growth inhibitory rate and apoptosis rate of the transfected cells was detected by MTT experiment and flow cytometry.ResultsThe expression of BTG2 gene presented an obvious decreasing in hepatocellular carcinoma. And the expression of BTG2 was related with the classification of hepatocellular carcinoma,with increasing of differentiation there was a gradually increasing trend. But it was not related with the staging,lymph node metastasis and distant metastasis of hepatocellular carcinoma. After transfecting with pcDNA3.3-BTG2,the expression of BTG2 protein of the transfected HEPG2 cells up-regulated significantly. Comparing to the control cells,the apoptosis of experimental group cells increased significantly(P<0.01).ConclusionThere is the expression decreasing of BTG2 gene in hepatocellular carcinoma. The over-expression of BTG2 gene can inhibit proliferation and increase apoptosis of HepG2 cells.

human hepatocellular carcinoma; BTG2 gene; HepG2 cell; proliferation; apoptosis

10.11724/jdmu.2013.06.05

R735.7

A

1671-7295(2013)06-0530-03

吳杰,宋磊,趙丹懿,等.肝細(xì)胞癌中BTG2基因的表達(dá)及其對肝細(xì)胞癌細(xì)胞增殖和凋亡影響的研究[J].大連醫(yī)科大學(xué)學(xué)報(bào)，2013,35(6)：530-532，546.

遼寧省科技發(fā)展計(jì)劃項(xiàng)目基金項(xiàng)目(2010225034)

吳 杰(1987-)，男，湖北黃石人，碩士研究生。E-mail：wjeastlife@163.com

宋 磊，副教授。E-mail：songlei_1975@126.com

2013-10-22；

2013-11-26)