方成俊陳俊玉王碧生楊奇志潘迎芬陳 暉陳旭新

（1.東山出入境檢驗(yàn)檢疫局 福建東山 363401；2.美國(guó)Protein Simp1e公司中國(guó)廣州辦事處 廣州 510000）

對(duì)蝦桃拉綜合征病毒（TSV）于1992年最早出現(xiàn)在南美最大對(duì)蝦養(yǎng)殖國(guó)家厄瓜多爾，對(duì)蝦感染病毒后死亡率高達(dá)40%～95%，曾引起美洲對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)的巨大損失，與對(duì)蝦白斑綜合征病毒（WSSV）、對(duì)蝦傳染性皮下及造血組織壞死病毒（IHHNV）一起被FAO稱為“影響世界對(duì)蝦養(yǎng)殖的三大病害”。對(duì)蝦桃拉綜合征病毒基因組為單鏈RNA病毒，暫歸于小RNA病毒科，該病毒主要感染西半球的對(duì)蝦品種，如南美白對(duì)蝦、凡納對(duì)蝦（P.vannamei）、藍(lán)腳細(xì)對(duì)蝦（P.setiferus）等，其中以南美白對(duì)蝦最為敏感，因?yàn)門(mén)SV在其體內(nèi)能迅速增殖并向外釋放。近幾年由于我國(guó)成功引進(jìn)南美白對(duì)蝦，大規(guī)模養(yǎng)殖已開(kāi)始，我國(guó)對(duì)蝦產(chǎn)量的50%以上都來(lái)自于南美白對(duì)蝦，如果該病在我國(guó)流行并蔓延，將對(duì)我國(guó)的對(duì)蝦養(yǎng)殖業(yè)造成沉重的打擊。據(jù)報(bào)道，對(duì)蝦桃拉綜合征已在我國(guó)臺(tái)灣地區(qū)發(fā)生過(guò)大面積暴發(fā)，在廣東、廣西、海南、福建等省沿海海水對(duì)蝦養(yǎng)殖密集區(qū)也有發(fā)生。以標(biāo)記特異性熒光探針為特點(diǎn)的熒光定量PCR技術(shù)（F1uorescence Quantitative PCR，F(xiàn)Q-PCR），如 TaqMan探針、HybProbe雜交探針技術(shù)，集PCR和探針雜交技術(shù)為一體，直接探測(cè)PCR過(guò)程中的熒光變化，實(shí)現(xiàn)DNA模板的準(zhǔn)確定量結(jié)果，整個(gè)過(guò)程實(shí)行閉管式實(shí)時(shí)測(cè)定，是目前最先進(jìn)的PCR技術(shù)。目前國(guó)內(nèi)還未有應(yīng)用實(shí)時(shí)熒光PCR技術(shù)進(jìn)行桃拉綜合征病毒檢測(cè)的研究報(bào)道。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料 對(duì)蝦桃拉綜合征病毒毒株由南海水產(chǎn)研究所提供，其他對(duì)照毒株（皮氏桿狀病毒、斑節(jié)對(duì)蝦型桿狀病毒、中腸腺壞死桿狀病毒、傳染性皮下造血壞死病毒、肝胰腺細(xì)小病毒和呼腸孤病毒）由本單位保存。試驗(yàn)對(duì)蝦采自福建省和廣東省各養(yǎng)殖場(chǎng)。Taq酶和AMV反轉(zhuǎn)錄酶為T(mén)aKaRa公司產(chǎn)品。實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀型號(hào)為羅氏LightCyc1er1.5。

1.2 方法

1.2.1 樣本RNA的提取 取患蝦肝臟，放于滅過(guò)菌的研缽中，加入無(wú)菌處理和DEPC處理過(guò)的500μL PBS或生理鹽水，進(jìn)行快速研磨，直至無(wú)固體物存在。收集研磨產(chǎn)生的液體移到離心管中6 000 r/min離心20 s，取上清備用。取若干個(gè)1.5 mL經(jīng)滅菌的無(wú)RNA酶污染的離心管，作好標(biāo)記。首先各加入600μL Trizo1，然后分別加入相應(yīng)編號(hào)的樣本上清液各200μL，吸打混勻，再加入200μL氯仿，振蕩混勻。靜置5 min，12 000 r/min離心10 min。分別吸取各管中的上層液相（切勿吸入下層液體）轉(zhuǎn)移至新的作好相應(yīng)標(biāo)記的1.5 mL無(wú)RNA酶污染的離心管中，加入-20℃預(yù)冷的異丙醇400μL，顛倒混勻，靜置5 min，12 000 r/min離心10 min。輕輕倒去上清，倒置于吸水紙上，吸干液體；加入700μL 75%乙醇，顛倒洗滌，12 000 r/min離心5 min；輕輕倒去上清，倒置于吸水紙上，盡量吸干液體。4 000 r/min離心10 s，用微量加樣器盡量將殘余液體吸干，室溫干燥1～5 min。加入15μL DEPC水，輕彈混勻，溶解管壁上RNA，保存于-18℃以下備用。

1.2.2 引物與探針 上游引物：5’-CTAATATTGTCATGTATCCTTGGGTG-3’， 下 游 引 物 ：5’-ATACTGGAGCACGCGTTACTGA-3’，探針：FAM-5’-CCAGCAGATGTTCCTGAGGAGCCC-3’-TAMRA。根據(jù)各引物的分子量以及合成時(shí)的OD值，計(jì)算每個(gè)引物和探針的儲(chǔ)存液濃度，然后用RNase Free水溶解稀釋，分裝后于-20℃貯存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.3 實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系與循環(huán)條件實(shí)時(shí)熒光定量PCR反應(yīng)體系見(jiàn)表1。循環(huán)條件為step1：50 ℃ 30 min，95 ℃ 2 min；step2：95 ℃ 5 s，60℃ 40 s，40個(gè)循環(huán)。

表1 Taura病毒熒光PCR反應(yīng)體系的各組分情況

1.2.4 閥值設(shè)定與結(jié)果分析 閥值設(shè)定原則為超過(guò)陰性對(duì)照擴(kuò)增曲線（無(wú)規(guī)則噪音線）的最高點(diǎn)。Cp值＞45為陰性，Cp值＜45為陽(yáng)性，Cp值在 44～46的標(biāo)本需重新測(cè)定一次，再按上述要求判定。陽(yáng)性標(biāo)本定量數(shù)據(jù)的測(cè)定，實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀會(huì)根據(jù)各個(gè)標(biāo)準(zhǔn)品測(cè)得的et值繪制成標(biāo)準(zhǔn)曲線后儀器自動(dòng)計(jì)算陽(yáng)性樣本的拷貝數(shù)據(jù)并在電腦界面上顯示。

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)蝦桃拉綜合征病毒實(shí)時(shí)熒光定量PCR的建立 為驗(yàn)證設(shè)計(jì)、合成的引物和探針的性能，分別利用針對(duì)Taura病毒所設(shè)計(jì)的各套引物探針，進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增，篩選出能夠工作的引物與探針最佳組合。同時(shí)，進(jìn)行反應(yīng)體系以及PCR反應(yīng)程序的優(yōu)化。

在進(jìn)行Taura病毒實(shí)時(shí)熒光PCR反應(yīng)時(shí)，需對(duì)所用儀器中每個(gè)檢測(cè)孔設(shè)置相應(yīng)的單熒光信號(hào)收集，選擇的熒光檢測(cè)通道應(yīng)與探針?biāo)鶚?biāo)記的熒光報(bào)告基團(tuán)的波長(zhǎng)一致，如Taura病毒FAM檢測(cè)收集。具體設(shè)置方法因儀器而異，應(yīng)參照儀器使用說(shuō)明書(shū)。

2.2 引物探針組合篩選 通過(guò)檢索文獻(xiàn)，確定靶基因，從GeneBank下載所有Taura病毒的序列，用生物軟件進(jìn)進(jìn)序列比對(duì)，截取最一致的序列進(jìn)行引物探針設(shè)計(jì)，將設(shè)計(jì)好的引物探針在GeneBank上進(jìn)行B1ast比對(duì)，驗(yàn)證引物探針的保守性。隨后進(jìn)一步試驗(yàn)篩選出最佳引物和探針組合，以確定為本方法中所使用的引物和探針的兼容性和效率，并進(jìn)行相關(guān)的優(yōu)化最佳PCR反應(yīng)濃度組、反應(yīng)條件、特異性、靈敏度和適用性測(cè)試。選擇的引物探針序列位置分別見(jiàn)圖1，核酸序列見(jiàn)表2。

圖1 對(duì)蝦桃拉綜合征病毒引物和探針的設(shè)計(jì)

表2 對(duì)蝦桃拉綜合征病毒引物探針序列

2.3 體系優(yōu)化結(jié)果

2.3.1 Taq酶的優(yōu)化 Taq酶用量（以單位U計(jì)）從1～5以1單位為梯度遞增。從試驗(yàn)結(jié)果中可知，不同酶用量對(duì)Cp值的影響很小，Taq酶用量分別為1 U、2 U、3 U、4 U和5 U時(shí)，陽(yáng)性模板的Cp值在23.16～23.94的較狹窄范圍內(nèi)波動(dòng)。但選定4 U Taq酶進(jìn)行反應(yīng)時(shí)，反應(yīng)體系的熒光增量最高。故選擇4 U Taq酶作為本熒光PCR反應(yīng)中使用的Taq酶用量。

2.3.2 Mg2+用量?jī)?yōu)化 將25 mM MgC12加樣量從3～6μL，以1μL為梯度遞增。從多次重復(fù)試驗(yàn)結(jié)果可知，25 mM MgC12加樣量在3μL以上時(shí)對(duì)Cp值的影響很小，但在6μL時(shí)反應(yīng)體系的熒光增量最高，所以選定25 mM MgC12加樣量為6μL作為本熒光PCR反應(yīng)中單個(gè)反應(yīng)的用量。

2.3.3 引物探針用量?jī)?yōu)化 將10 mM的引物加樣量從 0.25～1μL遞增，10 mM的探針加樣量從0.125～0.5μL遞增。將不同濃度的引物和探針配比，用所提取的核酸進(jìn)行擴(kuò)增。從多次重復(fù)的試驗(yàn)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)：不同濃度的引物、探針對(duì)于該陽(yáng)性模板Cp值基本穩(wěn)定在22.18～23.86，但引物濃度為10μM、加樣量為2μL，Taura病毒探針濃度為10μM、加樣量為0.5μL的熒光擴(kuò)增效率較高，效率在90%～100%。所以，選定2條引物加樣量均為2μL，Taura病毒探針加樣量0.5μL作為熒光PCR反應(yīng)的引物和探針濃度。

2.3.4 循環(huán)條件優(yōu)化結(jié)果 試驗(yàn)結(jié)果顯示，采用循環(huán)條件一的體系無(wú)論是Cp值還是曲線的擴(kuò)增效率都較循環(huán)條件二的結(jié)果好，故選擇循環(huán)條件一作為熒光PCR擴(kuò)增時(shí)的循環(huán)條件。

循環(huán)條件一為step1：50℃ 30 min，95℃ 2 min；step2：95 ℃ 5 s，60 ℃ 40 s，40 cyc1es。循環(huán)條件二為step1：50 ℃ 30 min，95 ℃ 2 min；step2：95 ℃ 5 s，55 ℃ 10 s，72 ℃ 20 s，40 cyc1es。

2.4 實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.4.1 實(shí)時(shí)熒光PCR擴(kuò)增結(jié)果 為檢測(cè)Taura病毒設(shè)計(jì)的一套引物和探針，其擴(kuò)增效果很好，出現(xiàn)了特異且典型的檢測(cè)曲線，Cp值約為23，擴(kuò)增效果見(jiàn)圖2。

圖2 Taura病毒樣品模板擴(kuò)增曲線

2.4.2 靈敏度試驗(yàn)結(jié)果 取Taura病毒標(biāo)準(zhǔn)毒株，按 10-1、10-2、10-3、10-4、10-5、10-6、10-7的倍數(shù)梯度稀釋，取最后5個(gè)梯度的毒株樣品進(jìn)行熒光PCR檢測(cè)，以確定該方法最低檢出濃度，具體結(jié)果見(jiàn)表3和圖3。本研究建立的熒光PCR方法到10-6稀釋度時(shí)還可以檢出，檢出限在450個(gè)病毒拷貝左右，比普通PCR方法的10-4檢測(cè)限高100倍。

表3 熒光PCR檢測(cè)法結(jié)果

圖3 Taura病毒實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)結(jié)果

2.4.3 特異性試驗(yàn)結(jié)果 用Taura病毒的實(shí)時(shí)熒光PCR體系檢測(cè)收集到的所有Taura病毒毒株，以及常見(jiàn)的其他對(duì)蝦病毒毒株。特異性試驗(yàn)結(jié)果如表4和圖4。所有的Taura病毒毒株檢測(cè)結(jié)果均為陽(yáng)性，而非Taura病毒毒株檢測(cè)結(jié)果為陰性，熒光PCR檢測(cè)結(jié)果的特異性為100%。

2.4.4 檢測(cè)時(shí)間優(yōu)化結(jié)果 普通PCR檢測(cè)試驗(yàn)共需8個(gè)步驟：樣本DNA提取、DNA擴(kuò)增、瓊脂糖配制、制電泳板、加樣、電泳、結(jié)果報(bào)告、擴(kuò)增片段，約需240 min。實(shí)時(shí)熒光定量PCR僅需前面2步，通過(guò)優(yōu)化循環(huán)條件，檢測(cè)時(shí)間約45～60 min，約為普通PCR檢測(cè)方法的1/4。

3 討論

3.1 引物探針設(shè)計(jì)原理 實(shí)時(shí)熒光PCR的引物與探針設(shè)計(jì)應(yīng)該遵循以下原則：（1）選擇病原體RNA不形成高級(jí)結(jié)構(gòu)的區(qū)域進(jìn)行設(shè)計(jì)，保持GC含量在30%～80%，引物Tm值為58～60℃，引物對(duì)間不能形成二聚體或二聚體的自由能應(yīng)大于-3.5 kc/m，單個(gè)引物自身形成發(fā)夾結(jié)構(gòu)的自由能也必須大于-3.5 kc/m。在引物序列中，不能出現(xiàn)連續(xù)的G，而且3’端盡量避免G或C的出現(xiàn)，在引物的最后5個(gè)堿基內(nèi)，不應(yīng)有兩個(gè)以上的G或C，以便提高引物的特異性。（2）選擇沒(méi)有RNA自身二聚體的區(qū)域進(jìn)行探針設(shè)計(jì)，保持GC含量在30%～80%，探針的Tm值為68～70℃，5’端不能是G，探針自身不形成二聚體。另外，上游引物與探針之間距離不能相距太遠(yuǎn)。擴(kuò)增的目的核酸片斷大小應(yīng)在70～150 bp。

表4 Taura病毒熒光PCR檢測(cè)特異性試驗(yàn)

圖4 Taura病毒特異性試驗(yàn)

Taura病毒的探針引物的設(shè)計(jì)，通過(guò)下載Gen－Bank中所有Taura病毒的基因組序列，進(jìn)行比對(duì)，找到該病毒的高度保守區(qū)，將該保守區(qū)放入Gen－Bank中進(jìn)行B1ast比對(duì)，找出其與其他物種的同源區(qū)，在設(shè)計(jì)引物和探針時(shí)避開(kāi)這些同源區(qū)。這樣設(shè)計(jì)出來(lái)的引物探針對(duì)，再進(jìn)行B1ast對(duì)比，以分析其與其他物種的同源性，以評(píng)價(jià)其可以造成的錯(cuò)檢可能。最終的生物信息學(xué)分析顯示，所設(shè)計(jì)的引物和探針相對(duì)Taura病毒的序列而言高度保守，相對(duì)其他非Taura病毒的所有其他物種而言非常特異。因而，通過(guò)嚴(yán)格的探針設(shè)計(jì)原則，熒光PCR檢測(cè)方法在理論上切實(shí)可行。

3.2 Taura病毒實(shí)時(shí)熒光PCR的特異性 用Taura病毒實(shí)時(shí)熒光PCR試劑分別檢測(cè)多種對(duì)蝦病毒，試驗(yàn)結(jié)果顯示，Taura病毒毒株檢測(cè)結(jié)果為陽(yáng)性，而非Taura病毒毒株檢測(cè)結(jié)果為陰性，說(shuō)明熒光PCR引物TrPf80、TrPr223和引物TrPb172對(duì)Taura病毒毒株的檢測(cè)特異性為100%。Taura病毒熒光PCR檢測(cè)方法的高度特異性很好地避免了許多方法在檢測(cè)過(guò)程中出現(xiàn)的錯(cuò)檢和漏檢現(xiàn)象，因此，具有顯著的優(yōu)越性。

3.3 Taura病毒實(shí)時(shí)熒光PCR的靈敏度 通過(guò)一系列的靈敏度試驗(yàn)及統(tǒng)計(jì)學(xué)數(shù)據(jù)表明，Taura病毒實(shí)時(shí)熒光PCR檢測(cè)方法的靈敏度均達(dá)到了10-6（450個(gè)病毒拷貝）的水平，每個(gè)反應(yīng)管的檢測(cè)靈敏度則達(dá)到了百位數(shù)。由于整個(gè)反應(yīng)的靈敏度受很多因素影響，如RNA的提取方法、反應(yīng)體系中各成分的濃度、反應(yīng)條件的設(shè)置以及儀器本身的檢測(cè)性能等都能顯著影響系統(tǒng)靈敏度。

［1］ 世界動(dòng)物衛(wèi)生組織（OIE）.水生動(dòng)物疾病診斷手冊(cè)［M］.3版.國(guó)家質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)檢疫總局，譯.北京：中國(guó)農(nóng)業(yè)出版社，2000：165-171.

［2］ 江育林，高隆英，史秀杰，等.用RT-PCR快速檢測(cè)Taura綜合征病毒［J］.檢驗(yàn)檢疫科學(xué)，2004，14（2）：8-9.

［3］ 熊煒，邱璐，李健，等.RT-PCR檢測(cè)Taura綜合征病毒方法改進(jìn)及應(yīng)用［J］.中國(guó)動(dòng)物檢疫，2005，22（12）：29-31.

［4］ 謝芝勛，龐耀珊，鄧顯文，等.多重RT-PCR同時(shí)檢測(cè)鑒別三種對(duì)蝦病毒的研究與應(yīng)用［J］.病毒學(xué)報(bào)，2005，21（5）：393-396.

［5］ 黃新新，莫?jiǎng)偬m，陸承平.RT-PCR法檢測(cè)我國(guó)東南沿海凡納濱對(duì)蝦的桃拉綜合征病毒［J］.中國(guó)病毒學(xué)，2005，20（5）：546-548.

［6］ 龐耀珊，謝芝勛，何競(jìng)銘，等.二溫式RT-PCR檢測(cè)對(duì)蝦Taura綜合征病毒的研究［J］. 海洋科學(xué)，2004，28（2）：54-57.

［7］ 陳信忠，龔艷清，孔繁德，等.應(yīng)用RT-PCR方法從進(jìn)境南美白對(duì)蝦親蝦中檢出桃拉綜合征病毒（Taura syndrome virus）［J］.中國(guó)動(dòng)物檢疫，2003，20（12）：21-22.