于曉紅, 王小明, 朱 皓, 李 真, 劉 俊

(1. 大連醫(yī)科大學 附屬第一醫(yī)院 心內(nèi)科，遼寧 大連 116011；2. 中國協(xié)和醫(yī)科大學 基礎醫(yī)學院 病理生理系，北京 100005)

基礎醫(yī)學

銀杏內(nèi)酯B對TNFα誘導的人內(nèi)皮細胞活性氧產(chǎn)生的影響及其機制

于曉紅>1, 王小明>2, 朱 皓>1, 李 真>1, 劉 俊>1

(1. 大連醫(yī)科大學 附屬第一醫(yī)院 心內(nèi)科，遼寧 大連 116011；2. 中國協(xié)和醫(yī)科大學 基礎醫(yī)學院 病理生理系，北京 100005)

目的探討銀杏內(nèi)酯B(GB)對TNFα刺激的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(HUVECs)中活性氧(ROS)產(chǎn)生的影響及其機制。方法將預先培養(yǎng)好的HUVECs分組：正常對照組；TNFα刺激組；GB預處理組:分別用GB(25 mg/L)，GB(50 mg/L)，GB(100 mg/L)預處理細胞1 h后再用TNFα刺激24 h；質粒轉染組:用轉染p47phox的siRNA作用24 h后再用TNFα刺激24 h。用小分子RNA干擾(siRNA)技術消除人臍靜脈內(nèi)皮細胞的NADPH 氧化酶p47phox亞基； 用分子探針2，7-DCF測定各組細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生量；用RT-PCR、細胞免疫組化及Western blotting等方法檢測處理后各組細胞的p47phoxmRNA和蛋白的表達。結果TNFα刺激使細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生量較對照組增加了155.4%(P=0.003)；GB(25 mg/L),GB(50 mg/L),GB(100 mg/L) 分別使TNFα誘導的HUVECs內(nèi)ROS的水平降低了9.2%(P=0.157)，35.4%(P=0.014)，48.0%(P=0.005)。TNFα作用細胞24 h后， p47phox的mRNA表達水平較對照組增加了212.8%(P=0.009)，蛋白表達增加了156.2%(P=0.001)；GB預處理使TNFα誘導的p47phoxmRNA表達水平降低了43.6%(P=0.021)，蛋白表達水平降低了53.0%(P=0.002)。p47phox的siRNA完全阻斷TNFα誘導ROS的產(chǎn)生。結論GB能夠抑制內(nèi)皮細胞中TNFα誘導的ROS的產(chǎn)生，主要機制是通過抑制NADPH氧化酶p47phox亞基的表達。

銀杏內(nèi)酯B；腫瘤壞死因子α；內(nèi)皮細胞；活性氧

血管內(nèi)皮細胞損傷是動脈粥樣硬化、高血壓等常見心血管病的重要發(fā)病原因?；钚匝?reactive oxygen species, ROS)的過度產(chǎn)生或與其清除機制的失衡能夠導致氧化應激，損害血管內(nèi)皮細胞的功能，甚至導致細胞凋亡或壞死[1-2]。因此，有效地阻斷ROS引起的血管內(nèi)皮細胞的氧化應激損傷是預防動脈粥樣硬化、高血壓等心血管疾病的重要途徑之一。近年來，銀杏葉提取物以其眾多的有效成分在治療心腦血管疾病方面引起國內(nèi)外學者的重視，對其化學成分，藥理作用及應用作了大量的研究工作，但對其是否能阻斷ROS引起的人臍靜脈內(nèi)皮細胞(human umbilical vein endothelial cells, HUVECs)中氧化應激損傷報道較少。本研究旨在探討銀杏內(nèi)酯B(ginkgo biloba, GB)對腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor, TNFα)刺激的HUVECs中ROS產(chǎn)生的影響及其機制。

1 材料和方法

1.1 材 料

主要試劑：Medium 200培養(yǎng)基、50×低血清細胞生長補充物為美國Cascade公司產(chǎn)品；TNFα和RNAi-Ready pSIREN-Shuttle 載體為美國R&D公司產(chǎn)品；銀杏內(nèi)酯B購自國家藥品監(jiān)督管理局生物制品檢定所；Ⅰ型膠原酶和胰酶購自美國Sigma公司；TRIZOL試劑opti-MEM Ⅰ 培養(yǎng)基和 LIPOFECTAMINETM 試劑為美國Giboco公司產(chǎn)品；p47phox抗體購自美國Santa Cruz 公司；siRNA片段、p47phox等基因的擴增引物由上海博亞公司合成；其余試劑均為進口分裝或國產(chǎn)分析純化。

1.2 方 法

1.2.1 p47phoxsiRNA表達載體的構建：根據(jù)p47phox的基因序列設計并合成siRNA片段，其序列為：5′GATCCGCTATGCAGGTGAGCCATACTTCAAGAGA-GTATGGCTCACCTGCATAGTTTTTACGCGTG3′和5′AATTCACGCGTAAAAAACTATGCAGGTGAGCCATA-CTCTCTTGAAGTATGGCTCACCTGCATAGCG3′,將兩段互補的寡核苷酸退火后進行5′末端磷酸化，反應體系為10 μL，其中10×T4 DNA多核苷酸激酶反應緩沖液(Tris-HCl 500 mmol/L, MgCl2100 mmol/L, DTT 50 mmol/L )1 μL,ATP(10 mmol/L)2.5 μL,退火產(chǎn)物2.5 μL，T4 DNA 多核苷酸酶(10 U/μL ) 1 μL,ddH2O 3 μL。反應在37 ℃進行30 min。將磷酸化后的產(chǎn)物與具有BamH1和EcoR1黏性末端的RNAi-Ready pSIREN-Shuttle 載體相連接，反應體系為：10×T4 DNA 連接酶反應緩沖液(Tris-HCl 660 mmol/L, MgCl266 mmol/L,DTT 100 mmol/L, ATP 1 mmol/L)1 μL,RNAi-Ready pSIREN-Shuttle 載體 1 μL,磷酸化產(chǎn)物4 μL,T4 DNA連接酶1 μL,ddH2O 3 μL，總體系10 μL，16 ℃反應16 h。

將5 μL連接產(chǎn)物轉化大腸桿菌DH5α感受態(tài)細胞，用北京天為時代公司的DP109型質粒小量提取試劑盒(無內(nèi)毒素型)提取質粒。構建成功的p47phoxsiRNA表達載體，最后經(jīng)酶切鑒定和測序證實。

1.2.2 HUVECs的培養(yǎng)及處理：HUVECs的分離參照Jaffe等[4]的方法進行。無菌條件下取健康新生兒臍帶，用0.2%膠原酶消化，收集細胞，加入含50×低血清細胞生長補充物的Medium 200培養(yǎng)液，置37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，待細胞達90%融合時，進行實驗或傳代，本實驗選用第2～5代細胞，采用內(nèi)皮細胞的形態(tài)及其特異表達Ⅷ因子免疫組化法進行了陽性鑒定。細胞分為(1)正常對照組：正常培養(yǎng)的HUVECs細胞；(2)TNFα刺激組：應用TNFα(200 U/mL)作用24 h；(3)GB預處理組：分別用GB(25 mg/L)，GB(50 mg/L)，GB(100 mg/L)預處理1 h，之后再用TNFα(200 U/mL)作用24 h；(4)質粒轉染組：用轉染p47phox的siRNA作用24 h，之后再用TNFα(200 U/mL)作用24 h，同時應用轉染空載體(hU6pro vector)作為對照。各組光鏡下檢測活細胞數(shù)均>95%。

1.2.3 質粒轉染：HUVECs接種至6孔板，用無血清、無抗生素培養(yǎng)基培養(yǎng)至80%～90%融合時轉染p47phox的siRNA，同時用轉染空載體(hU6pro vector)的細胞作對照。轉染時，先將轉染試劑lipofectinTM3 μL和質粒DNA 1 μg分別用Opti-MEM培養(yǎng)基稀釋至100 μL，然后混勻，在室溫孵育15～45 min后加入800 μL Opti-MEM培養(yǎng)基，將混和液均勻加入6孔板內(nèi)。細胞移入37 ℃的孵箱中孵育6 h，并更換完全培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)18 h后加入TNFα。

1.2.4 細胞內(nèi)ROS的測定：細胞內(nèi)ROS測定采用2,7-二氯熒光黃(DCF)。2,7-DCF 以二乙酯的形式進入細胞, 在ROS 的作用下轉變?yōu)?,7-DCF，其發(fā)射熒光強度反映氧應激水平。于測定ROS前，在經(jīng)過上述處理的HUVECs中加入50 μmol/L 2,7-DCF，作用50 min。用0.25%胰蛋白酶消化細胞，收集至1.5 mL EP管中，細胞用Hank's 液洗2次，用1 mL Hank's 液重懸細胞，然后用熒光分光光度計測定熒光強度(fluorescence intensity，F(xiàn)I)，其激發(fā)波長為488 nm, 發(fā)射波長為510 nm。

1.2.5 半定量RT-PCR分析：用Trizol試劑按說明提取細胞總RNA，測定RNA濃度后進行RT-PCR反應。反轉錄反應體系為20 μL，含 RNA 2 μg，隨機引物0.5 μg，M-MLV RT 5×緩沖液(Tris-HCl 250 mmol/L, KCl 375 mmol/L, MgCl215 mmol/L, DTT 50 mmol/L)4 μL, dNTPs(2.5 mmol/L) 3 μL, MMLV反轉錄酶 100 U和ddH2O 10 μL，37 ℃反應90 min。p47phox基因的上游引物：5′ACC TTC ATC CGT CAC ATC G 3′,下游引物：5′TCA AAC CAC TTG GGA GCT G 3′，擴增產(chǎn)物p47phox基因為250 bp；內(nèi)參照GADPH的上游引物：5′GCG CCT GGT CAC CAG GGC TGC TT 3′，下游引物：5′TGC CGA AGT GGT CGT GGA TGA CCT 3′，擴增產(chǎn)物為465 bp。反應條件：95 ℃預變性3 min, 于80 ℃水浴中加入Taq 酶后,95 ℃變性40 s,52 ℃退火40 s,72 ℃延伸90 s,循環(huán)35次后于72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物以1.0%瓊脂糖凝膠電泳，并在紫外線下成像、掃描。

1.2.6 Western blotting 檢測：胞核蛋白的制備：參考文獻進行[5]，棄去培養(yǎng)基，冷PBS沖洗2遍，刮下細胞于15 mL離心管中離心5 min,除去上清。加入300 μL Buffer A,冰浴30 min,加入10% NP-40 18 μL，振蕩10 s，吹打。4 ℃， 離心10 min，棄去上清。加入100 μL Buffer B，充分吹打于-70 ℃和37 ℃凍融循環(huán)1次，4 ℃，離心15 min,收集上清液即為胞核蛋白，Bradford蛋白定量后分裝，于-70 ℃保存?zhèn)溆?。Buffer A、B的配制參照文獻進行[6]。

Western 印跡分析：參照文獻進行[6]，20 μg胞核蛋白經(jīng)10% SDS聚丙烯酰胺電泳分離后，電轉到PVDF膜上，與p47phox抗體4 ℃孵育過夜，與相應的二抗室溫孵育1 h,采用增強化學發(fā)光法進行檢測。

1.2.7 細胞免疫化學分析：PBS洗細胞3次，4%多聚甲醛固定，4 ℃，30 min。PBS沖洗3次，新配制的3% H2O2作用細胞30 min，以消除內(nèi)源性過氧化物酶(HP)的活性。去上清，PBS沖洗3次，0.5% Triton X-100 PBS作用細胞20 min，以增加細胞膜通透性。去上清，PBS沖洗3次，10%山羊血清室溫孵育15 min，以封閉所有抗體。棄血清，加入1∶100倍稀釋的相關抗原抗體(陰性對照組除外)，置于濕盒內(nèi)，4 ℃過夜。PBS沖洗3次，加入1∶200稀釋的生物素標記的二抗，濕盒內(nèi)室溫作用15～30 min。PBS沖洗3次，加入1∶100稀釋的HP標記的鏈霉卵白素(Strepavdin)，37 ℃，濕盒內(nèi)作用15～30 min。PBS沖洗3次，加入現(xiàn)配制的DAB液發(fā)色，顯微鏡下觀察，及時流水終止反應，明膠封片，照相。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結 果

2.1 GB對TNFα刺激的人內(nèi)皮細胞ROS產(chǎn)生的影響

結果如圖1所示，TNFα(200 U/mL)作用 HUVECs 24 h 使細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生量較對照組增加了155.4%(P=0.003)；預先用不同濃度的GB處理HUVECs 1 h，再以TNFα作用24 h，GB劑量依賴的抑制TNFα誘導的細胞內(nèi)ROS的水平。GB(25 mg/L)，GB(50 mg/L)，GB(100 mg/L) 分別使TNFα誘導的HUVECs內(nèi)ROS的水平降低了9.2%(P=0.157)，35.4%(P=0.014)，48.0%(P=0.005)。

圖1 GB劑量依賴的抑制TNFα誘導的HUVECs內(nèi)ROS的水平

** compared with the controlP<0.01; # compared with the group treated by TNFα aloneP<0.05; ## compared with the group treated by TNFα aloneP<0.01

2.2 轉染p47phoxsiRNA對TNFα刺激內(nèi)皮細胞p47phoxmRNA和蛋白表達的影響

采用siRNA技術消除HUVECs的NADPH 氧化酶p47phox亞基后，在對照組的HUVECs中，p47phoxmRNA和蛋白的表達非常低，TNFα(200 U/mL)作用24 h后, p47phoxmRNA和蛋白的表達均較對照組明顯增加；但在轉染p47phoxsiRNA的細胞， TNFα作用后細胞內(nèi)幾乎未見p47phoxmRNA及蛋白的表達。見圖2和圖3。

2.3 轉染p47phoxsiRNA對TNFα刺激內(nèi)皮細胞ROS產(chǎn)生的影響

圖4顯示，TNFα(200 U/mL) 作用HUVECs 24 h后，細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生量較對照組增加了155.4%(P=0.003)；而轉染p47phoxsiRNA完全阻斷了TNFα誘導的細胞內(nèi)ROS的產(chǎn)生。

圖2轉染p47phoxsiRNA對TNFα誘導HUVECs內(nèi)p47phoxmRNA表達的影響

Fig 2 Effect of p47phoxsiRNA on TNFα-induced mRNA expression of p47phoxin HUVECs

1. 100 bp DNA ladder; 2. control; 3. TNFα; 4. p47phoxsiRNA+TNFα

圖3 免疫細胞化學方法檢測轉染p47phoxsiRNA對TNFα誘導HUVECs 中p47phox蛋白表達的影響 (×40)

A.對照組細胞，p47phox蛋白表達非常低；B.應用TNFα(200 U/mL)作用24 h后細胞內(nèi)p47phox蛋白表達明顯增加；C.轉染p47phoxsiRNA 24 h后再用TNFα(200 U/mL)作用24 h，細胞內(nèi)幾乎未見p47phox蛋白表達

圖4轉染p47phox的siRNA對TNFα誘導的HUVECs內(nèi)ROS產(chǎn)生的影響

** compared with the controlP<0.01; ## compared with the group treated by TNFα aloneP<0.01

2.4 GB對TNFα刺激內(nèi)皮細胞p47phoxmRNA和蛋白表達的影響

結果如圖5，6所示，在對照組的HUVECs中，p47phoxmRNA和蛋白的表達非常低，而TNFα(200 U/mL)作用24 h后，p47phox的mRNA表達水平較對照組增加了212.8%(P=0.009),蛋白表達增加了156.2%(P=0.001)；GB(50mg/L)預處理分別使TNFα誘導的p47phoxmRNA和蛋白表達下降43.6%(P=0.021)和53.0%(P=0.002)。

圖5 GB對TNFα誘導HUVECs中p47phoxmRNA表達的影響

Fig 5 Effects of GB on TNFα-induced mRNA expression of p47phoxin HUVECs

0：100 bp DNA ladder; 1：control; 2：TNFα; 3：GB+TNFα
** compared with the controlP<0.01; # compared with the group treated by TNFαaloneP<0.05

圖6 GB對TNFα誘導HUVECs中p47phox蛋白表達的影響

Fig 6 Effects of GB on TNFα-induced protein expression of p47phoxin HUVECs

** compared with the controlP<0.01; ## compared with the group treated by TNFα aloneP<0.01

3 討 論

近年來大量證據(jù)表明，NADPH氧化酶途徑是內(nèi)皮細胞ROS的主要來源之一。內(nèi)皮細胞NADPH氧化酶復合體由多個胞質和胞膜亞基組成，其中p47phox亞基非常重要，NADPH氧化酶的激活需要該亞基活化后由胞質轉移到膜上。本實驗觀察到，TNFα作用24 h后，HUVECs中p47phoxmRNA和蛋白表達均明顯增高，提示TNFα長時間作用后還存在p47phox亞基的重新合成，而轉染p47phoxsiRNA可以完全抑制p47phoxmRNA和蛋白的表達以及TNFα對ROS的誘導作用，提示NADPH氧化酶途徑是內(nèi)皮細胞ROS的主要來源。

抗氧化藥物能夠降低或消除氧化應激損傷，保護血管內(nèi)皮細胞的功能，對心血管疾病具有預防和治療的潛能。早期研究顯示，抗氧化藥物GB是銀杏葉的眾多有效成分之一，它在銀杏葉中含量為0.2%，可以通過抑制細胞色素P-450系統(tǒng)抑制ROS的生成[3]，具有強大的抗氧化作用[4-6]，在減輕體外培養(yǎng)細胞的氧化損傷、降低離體大鼠心臟的缺血再灌注損傷等過程中起重要作用[7-8]。已有很多報道表明，GB對神經(jīng)系統(tǒng)缺血-再灌注損傷具有明顯的保護作用。因此早已被用于中風等疾病的治療。本實驗結果顯示，GB劑量依賴的抑制TNFα誘導的HUVECs內(nèi)ROS的水平。提示GB具有抗氧化應激作用，與文獻報道結果一致。進一步研究結果顯示，50 mg/L 的GB明顯降低TNFα誘導的p47phoxmRNA和蛋白的表達。提示GB的抗氧化應激作用主要是通過抑制內(nèi)皮細胞NADPH氧化酶來源的ROS實現(xiàn)的。但是與文獻報道[3]不同的是，我們的結果顯示GB主要通過抑制NADPH氧化酶途徑影響ROS的生成，而不是主要通過抑制細胞色素P-450系統(tǒng)。

本研究組前期研究已經(jīng)證實[9-10]，轉染p47phox的siRNA能阻斷TNFα對ERK的激活和轉錄因子SP-1的核轉位，明顯抑制NF-ΚB的核轉位；明顯降低TNFα誘導的HO-1蛋白的表達及胞漿游離鈣水平。GB對TNFα刺激的HUVECs中ROS激活信號通路及基因表達的影響尚在進一步研究中。

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EffectofginkgobilobaongenerationofROSandthemechanisminvolvedinthetumornecrosisfactorα-stimulatedhumanendothelialcells

YUXiao-hong1,WANGXiao-ming2,ZHUHao1,LIZhen1,LIUJun1

(1.DepartmentofCardiology,theFirstAffiliatedHospitalofDalianMedicalUniversity，Dalian116011，China; 2.DepartmentofPathophysiology，BasicMedicalAcademy，PekingUnionMedicalCollege,Beijing100005,China)

ObjectiveTo investigate the effect of ginkgo biloba (GB) on generation of ROS and the mechanism involved in the tumor necrosis factor α-stimulated human endothelial cells.MethodsCultured HUVECs were divided into normal group; TNFα stimulation group; GB pretreatment group: HUVECs were stimulated 24 h by TNFα after pretreatment 1 h by GB(25 mg/L)，GB(50 mg/L)，GB(100 mg/L); Plasmid transfection group: HUVECs were stimulated 24 h by TNFα after pretreatment 24 h by p47phoxsiRNA.The siRNA expression vector for p47phoxwas constructed and used to block the NADPH oxidase in the HUVECs. The intracellular ROS production was detected by using 2,7-dichlorofluorescin diacetate as probe. The mRNA and protein expression of the p47phoxwas determined by using semiquantitative RT-PCR, immunocytochemistery analysis and western blotting analysis in each group after treatment.ResultsTNFα stimulation caused ROS output increased by 155.4% of control(P=0.003); GB was able to reduced the production of ROS in a dose-dependent manner, GB(25 mg/L),GB(50 mg/L),GB(100 mg/L) made the TNFα-induced ROS output decreased 9.2%(P=0.157)，35.4 %(P=0.014)，48.0% (P=0.005)respectively. TNFα stimulation caused p47phoxmRNA increased by 212.8% of control(P=0.009), and also increased p47phoxprotein expression by 156.2% of control(P=0.001); Pretreatment with GB attenuated TNFα-induced p47phoxmRNA by 43.6% (P=0.021)and protein by 53.0%(P=0.002). Knock down of the p47phoxsubunit for NADPH oxidase by siRNA abolished the production of ROS.ConclusionGB has a potent inhibitory effect on the ROS production in the TNFα- stimulated endothelial cells, mainly through the inhibition of NADPH oxidase.

ginkgo biloba；TNFα；endothelial cells；reactive oxygen species

10.11724/jdmu.2013.04.04

R339

A

1671-7295(2013)04-0320-05

于曉紅, 王小明, 朱皓，等.銀杏內(nèi)酯B對TNFα誘導的人內(nèi)皮細胞活性氧產(chǎn)生的影響及其機制[J].大連醫(yī)科大學學報，2013,35(4)：320-324.

遼寧省教育廳科學研究一般項目(L2011155、L2012321)

于曉紅(1970-)，女，遼寧大連人，主治醫(yī)師。E-mail：yuxiaohong0707@163.com

劉 俊，教授。E-mail：dalianliujun@medmail.com.cn

2013-05-07；

2013-06-18)