何軍鋒，嚴(yán)潔，黃惠勇，王超，李江山，謝夢(mèng)洲，屈婭婷

(湖南中醫(yī)藥大學(xué)，湖南 長沙 410208)

隨著人們生活水平的不斷提高，肥胖癥的發(fā)病率日益增高，其并發(fā)癥，如糖尿病、心血管疾病、癌癥等已成為嚴(yán)重影響人類健康的世界性醫(yī)學(xué)難題［1］。由于利用高脂飲食建立動(dòng)物模型(DIO)與人類肥胖的自然過程相近，進(jìn)而成為研究肥胖癥的重要方法之一。針灸減肥具有簡便有效，且無不良反應(yīng)等優(yōu)點(diǎn)［2］，因而備受關(guān)注。本研究擬觀察針刺足陽明經(jīng)穴對(duì)DIO大鼠胰島素抵抗及下丘腦胰島素受體后IRS1的影響。

1 材料和方法

1．1 模型建立

SD雄鼠(購于湖南中醫(yī)藥大學(xué))，體質(zhì)量50～70g。適應(yīng)性喂養(yǎng)1周，隨機(jī)分組:正常對(duì)照組(A組)10只，給予普通飼料(由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供);實(shí)驗(yàn)組60只，給予高脂飼料［3］(由湖南中醫(yī)藥大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供)。自由進(jìn)食飲水，室溫21～24℃。每2周稱重并記錄，進(jìn)行體重(BW)分析。大鼠肥胖判斷標(biāo)準(zhǔn):凡經(jīng)高脂飼料喂養(yǎng)12周后，SD大鼠的BW超過普通飼料喂養(yǎng)大鼠BW的20%作為實(shí)驗(yàn)肥胖大鼠。

1．2 動(dòng)物分組及干預(yù)

SD肥胖大鼠模型建立后，取30只肥胖大鼠，隨機(jī)分為肥胖模型組(模型組)、肥胖模型+針刺足陽明經(jīng)穴(針刺組)、針刺非經(jīng)穴組(非經(jīng)穴組)，每組10只。針刺組將清醒大鼠固定于特制的裝置，取單側(cè)四白、天樞、足三里、內(nèi)庭穴(隔天交替針另一側(cè))，局部75%酒精常規(guī)消毒后，針入3～5mm，接通電針儀，頻率為10Hz，強(qiáng)度3mA，以胡須及肢體微動(dòng)為度，時(shí)間15min，每天治療1次，治療6天休息1天，持續(xù)4周。穴位的定位參照《實(shí)驗(yàn)針灸學(xué)》常用實(shí)驗(yàn)動(dòng)物針灸穴位。針刺非經(jīng)穴組在固定大鼠后選擇四白、天樞、足三里、內(nèi)庭穴旁開非經(jīng)穴點(diǎn)針刺;正常組、模型組則行抓取固定，不作任何治療，持續(xù)4周。

1．3 指標(biāo)檢測(cè)

1．3．1 血清生化指標(biāo)檢測(cè) 大鼠取血前需過夜禁食8h，準(zhǔn)確測(cè)量體質(zhì)量(BW)，內(nèi)眥靜脈采血，使用強(qiáng)生牌穩(wěn)豪血糖儀測(cè)定空腹血糖(FPG)，離心分離血清，－80℃保存。放免法測(cè)定FINS水平。HOMA－指數(shù)(HOMA－index):(FINS×FPG)/22．5。

1．3．2 蛋白檢測(cè) 采用Western blot法［4］。－70℃冰箱里取出大鼠下丘腦組織，用細(xì)胞裂解液裂解，進(jìn)行超聲萃取后測(cè)定總蛋白濃度。分裝后置于－20℃冰箱保持。SDS－PAGE分離蛋白，轉(zhuǎn)置PVDF膜(Pierce產(chǎn)品)。5%的牛奶TBS－T封閉PVDF膜后，予Upstate公司的IRS1 及IRS1 抗磷酸酪氨酸抗體結(jié)合膜蛋白，4度搖床過夜;TBS－T洗膜后加HRP二抗，洗膜3次;PVDF膜予ECL法顯色后，X－膠片曝光，以 β－actin為對(duì)照，置于光密度儀下檢測(cè)IRS1 及酪氨酸磷酸化的相對(duì)含量。

1．4 統(tǒng)計(jì)處理 用SPSS 13．0 統(tǒng)計(jì)軟件處理，所有數(shù)據(jù)用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，多組均數(shù)比較用方差分析。

2 結(jié)果

2．1 體質(zhì)量變化 高脂飲食喂養(yǎng)12周后，模型組大鼠體質(zhì)量達(dá)(524．32±34．18)g，顯著高于空白組與針刺組(P ＜0．05 或 P＜0．01)，但與非經(jīng)穴組比較，無顯著差異。針刺足陽明經(jīng)穴組能顯著抑制高脂模型大鼠體質(zhì)量，與非經(jīng)穴組比較，具有顯著性差異(P＜0.05)。見表1。

表1 各組大鼠體質(zhì)量變化比較(±s，n=10)

表1 各組大鼠體質(zhì)量變化比較(±s，n=10)

注:與空白組比較，*P ＜0．05;與模型組比較，●P ＜0．05，●●P ＜0.01;與非經(jīng)穴組比較，○P ＜0．05。

空白組 56．12 ±5．18 467．12 ±28．15●●○模型組 58．64 ±6．85 524．32 ±34．18*針刺組 59．22 ±7．25 480．23 ±30．75＊●○非經(jīng)穴組 55．46 ±4．25 512．45 ±35．25*

2．2 干預(yù)后各生化指標(biāo)比較 與空白組比較，模型組及非經(jīng)穴組空腹血糖(FPG)、空腹胰島素(FINS)、HOMA－指數(shù)(HOMA－INDEX)均顯著升高(P＜0．01)。針刺組大鼠FPG、FINS、HOMA－INDEX均顯著下降，與模型組及非經(jīng)穴組比較，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0．01)。見表2。

空白組 4．56±0．97●○ 8．55±3．45●○ 1．88±1．22●○模型組 7．65 ±1．05* 15．43 ±3．28* 5．15 ±1．31*針刺組 5．22±0．86●○ 8．38±3．57●○ 2．16±1．19●○非經(jīng)穴組 7．26 ±0．77* 13．89 ±2．25* 4．85 ±1．45*

2．3 各組IRS－1 蛋白及其酪氨酸磷酸化水平

IRS－1 蛋白表達(dá)由低到高依次為模型組、非經(jīng)穴組、針刺組、空白組;各組組間比較，并無顯著性差異(P＞0．05)。肥胖模型組及非經(jīng)穴組IRS－1 酪氨酸磷酸化水平較低，空白組和針刺組均顯著高于模型組和非經(jīng)穴組(P＜0．01)，提示針刺足陽明經(jīng)穴可顯著改善肥胖模型的IRS－1 酪氨酸磷酸化水平。見表3。

表3 IRS－1 蛋白及其酪氨酸磷酸化比較(±s，n=10)

表3 IRS－1 蛋白及其酪氨酸磷酸化比較(±s，n=10)

注:與空白組比較，*P ＜0．01;與模型組比較，●P ＜0．01;與非經(jīng)穴組比較，○P ＜0．01。

空白組 94．12 ±9．18 132．22 ±11．24●○模型組 85．44 ±8．85 110．23 ±12．65*針刺組 90．282 ±10．25 128．64 ±12．45●○非經(jīng)穴組 87．45 ±7．89 114．14 ±11．98*

3 討論

以高脂飼料喂養(yǎng)大鼠是建立飲食誘導(dǎo)肥胖模型最常用的方法，這與人類肥胖發(fā)生的特點(diǎn)相似［5］。肥胖患者內(nèi)分泌代謝紊亂，普遍存在著高胰島素血癥，提示機(jī)體胰島素敏感性下降，存在嚴(yán)重的胰島素抵抗。胰島素經(jīng)血液循環(huán)到達(dá)靶組織，并與其上的胰島素受體α亞單位結(jié)合，激活胰島素受體β亞單位從而發(fā)生自磷酸化。被激活的胰島素受體β亞單位進(jìn)一步磷酸化細(xì)胞內(nèi)信號(hào)分子IRS－1，后者被磷酸化后表現(xiàn)出一種特異性結(jié)合位點(diǎn)，能募集并激活下游含有SH2 區(qū)域的蛋白質(zhì)，使得信號(hào)以激酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)下傳。IRS－1 作為胰島素受體信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)起始的一個(gè)重要信號(hào)分子，其蛋白表達(dá)及酪氨酸磷酸化程度的降低可引起胰島素生物效應(yīng)的減弱，最終引起胰島素抵抗［6］。

中醫(yī)學(xué)認(rèn)為，足陽明胃經(jīng)在能量代謝中起著樞紐作用。在針刺減肥的研究中，足陽明胃經(jīng)的穴位天樞、足三里、內(nèi)庭是最常用的腧穴［7］。蔡氏［8］的研究表明，針刺足三里、內(nèi)庭和胰俞，可顯著上調(diào)2型糖尿病大鼠肝組織IRS1 mRNA表達(dá)。我們前期研究表明，足陽明經(jīng)的四白穴與胃腸運(yùn)動(dòng)密切相關(guān)且兩者傳入信息可以在中樞匯聚［9－10］，它可能在肥胖研究中有著重要的作用。因此，本研究中選擇足陽明經(jīng)穴這四個(gè)腧穴作為研究對(duì)象。針刺足陽明經(jīng)穴的結(jié)果表明，這四個(gè)腧穴可顯著抑制高脂飲食誘導(dǎo)的肥胖，同時(shí)可較好地改善肥胖模型的胰島素抵抗?fàn)顟B(tài)。此外，讓人感興趣的是，針刺足陽明經(jīng)四白、天樞、足三里和內(nèi)庭，盡管對(duì)于IRS－1 蛋白表達(dá)并無顯著的提高，卻可顯著提高IRS－1 酪氨酸磷酸化水平，這與葉氏用中藥干預(yù)的結(jié)果頗為類似［11］，這意味著針刺可改善受體后信號(hào)傳導(dǎo)通路中的磷酸化水平，值得進(jìn)一步研究。

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