朱艷華，劉廷榮，閻雪瑩，王吉錫，許樹軍

(黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

磷酸川芎嗪藥理作用確切，臨床應(yīng)用廣泛。目前已有注射液、片劑、膠囊劑等劑型應(yīng)用于臨床，主要用于治療各種心腦血管疾病。磷酸川芎嗪溫敏凝膠通過鼻腔給藥，可以通過血腦屏障發(fā)揮藥效，其特性是在室溫下具有較好流動(dòng)性的液體，用藥后可在鼻腔溫度下形成凝膠狀，明顯延長藥物在鼻腔內(nèi)的滯留時(shí)間。然而有些鼻用制劑在給藥后會(huì)影響鼻腔和鼻黏膜纖毛系統(tǒng)的功能，嚴(yán)重時(shí)可使鼻黏膜纖毛運(yùn)動(dòng)發(fā)生不可逆的停止。所以本實(shí)驗(yàn)對磷酸川芎嗪溫敏凝膠使用時(shí)是否會(huì)對鼻腔有影響做了研究。

1 試劑與材料

光學(xué)顯微鏡XSZ－H型(重慶光學(xué)儀器廠);磷酸川芎嗪溫敏凝膠(批號20101203，自制);磷酸川芎嗪(TMPP，批號20100403，北京市燕京藥業(yè)有限公司);氯化鈉注射液(批號100718506，石家莊四藥有限公司);去氧膽酸鈉(批號20100305，北京奧博星生物技術(shù)有限公司);鹽酸麻黃堿注射液(批號20100706－2，東北制藥集團(tuán)公司沈陽第一制藥廠);其它試劑均為分析純。

中華大蟾蜍(體質(zhì)量30～35g)，雌雄兼用，黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)GLP實(shí)驗(yàn)中心提供。

2 方法與結(jié)果

2．1 纖毛毒性考察方法

選擇體質(zhì)量30～35g的中華大蟾蜍30只，隨機(jī)分為6組，每組5只。采用在體蟾蜍上腭模型法［1］。先將蟾蜍用探針破壞脊髓，然后將其仰臥固定在手術(shù)板上，使其上腭裸露，以防止吞咽藥液。在上腭黏膜處滴加藥液0．5ml，將上腭黏膜完全浸沒，浸潤30min。用生理鹽水將藥液沖洗凈，然后用眼科剪刀和鑷子將蟾蜍兩眼中間部位的上腭黏膜分離，約3mm×3mm大小。立即用生理鹽水沖洗黏膜的血塊、雜物等，將黏膜纖毛面向上平鋪于載玻片上，蓋上蓋玻片，生理鹽水制片，用40×10倍顯微鏡觀察纖毛擺動(dòng)情況。觀察結(jié)束后，將制片置于加有少量蒸餾水飽和層析缸中，密閉，環(huán)境溫度20～25℃。每隔一定時(shí)間將制片取出，在蓋玻片邊緣滴加適量生理鹽水，同法鏡下觀察纖毛擺動(dòng)情況，若纖毛仍有擺動(dòng)現(xiàn)象，則將標(biāo)本再放回層析缸中，繼續(xù)觀察，直至停止，記錄纖毛從給藥開始至停止擺動(dòng)所持續(xù)時(shí)間。

2．2 纖毛毒性評價(jià)方法

2．2．1 纖毛持續(xù)擺動(dòng)時(shí)間百分率

纖毛持續(xù)擺動(dòng)時(shí)間的百分率是受試液組的纖毛持續(xù)擺動(dòng)時(shí)間與生理鹽水對照組的纖毛持續(xù)擺動(dòng)時(shí)間的比值。百分率越高，表示藥物對纖毛運(yùn)動(dòng)影響越小，對纖毛毒性越小［2］。

2．2．2 纖毛形態(tài)學(xué)改變

采用可拍照的生物數(shù)碼顯微鏡，觀察給予各種受試藥液后的纖毛形態(tài)，并進(jìn)行拍照。

2．3 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2．3．1 纖毛持續(xù)擺動(dòng)時(shí)間百分率

給予原料藥磷酸川芎嗪(0．01%)和磷酸川芎嗪溫敏凝膠(0．01%)后，纖毛持續(xù)擺動(dòng)時(shí)間相對于生理鹽水的百分率在70%～80%之間，說明原料藥液和含藥凝膠均對纖毛運(yùn)動(dòng)有一定影響;而空白凝膠組的相對百分率較高，說明凝膠輔料無明顯纖毛毒性。結(jié)果見表1。

表1 受試溶液對纖毛持續(xù)擺動(dòng)時(shí)間的影響(±s，n=5)

表1 受試溶液對纖毛持續(xù)擺動(dòng)時(shí)間的影響(±s，n=5)

注:與生理鹽水組比較，*P ＜0．05。

受試溶液含量(%)纖毛持續(xù)擺動(dòng)時(shí)間(min)相對百分率(%)483．3 ±41．9 100鹽酸麻黃堿 1．0 446．7 ±26．2 92．4去氧膽酸鈉 1．0 纖毛基本脫落－空白凝膠－423．3±36．8 87．6 TMPP 原料藥 0．1 376．7 ±33．0 77．9*TMPP 溫敏凝膠 0．1 356．7 ±30．9 73．8生理鹽水－*

2．3．2 纖毛形態(tài)學(xué)變化

采用在體蟾蜍上腭模型法制片，光學(xué)顯微鏡下(×400)觀察各受試溶液組的纖毛形態(tài)及擺動(dòng)情況。生理鹽水組和鹽酸麻黃堿組，清晰整齊，有規(guī)律的向同一個(gè)方向擺動(dòng)，且十分活躍、頻率很高;去氧膽酸鈉組，視野范圍內(nèi)無法找到擺動(dòng)纖毛，纖毛已基本脫落，表明去氧膽酸鈉對纖毛運(yùn)動(dòng)有嚴(yán)重的不可逆的抑制作用，對黏膜組織有嚴(yán)重的破壞作用;空白凝膠組情況與鹽酸麻黃堿組相似，纖毛清晰可見，運(yùn)動(dòng)靈活，可見由于凝膠溶液粘度較大，凝膠輔料對纖毛運(yùn)動(dòng)有一定影響，但無明顯的纖毛毒性;而磷酸川芎嗪原料藥組及磷酸川芎嗪溫敏凝膠組觀察視野內(nèi)的纖毛數(shù)量和擺動(dòng)靈活度上相對于生理鹽水組及鹽酸麻黃堿組都有一定程度的減弱。說明藥物對纖毛運(yùn)動(dòng)有一定的影響。

3 討論

采用鹽酸麻黃堿(公認(rèn)無纖毛毒性)作為陰性對照，去氧膽酸鈉(公認(rèn)有嚴(yán)重纖毛毒性)作為陽性對照，以生理鹽水作為空白對照，評價(jià)磷酸川芎嗪原料藥、凝膠輔料、磷酸川芎嗪溫敏凝膠劑的鼻纖毛毒性。采用在體蟾蜍上腭模型法，以給藥后的中華大蟾蜍上腭纖毛持續(xù)擺動(dòng)時(shí)間百分率和纖毛形態(tài)學(xué)改變?yōu)橹笜?biāo)，考察了受試液對鼻纖毛的影響。

初步實(shí)驗(yàn)表明，含藥凝膠對纖毛有一定的毒性影響，空白凝膠抑制作用相對較小。此外，由于凝膠為半流體，有一定黏稠度，也可能是對纖毛擺動(dòng)有抑制的原因之一;再者離體組織自身的缺氧、分離黏膜時(shí)破壞黏液層，都可能成為影響纖毛運(yùn)動(dòng)停止的原因。

本實(shí)驗(yàn)采用在體蟾蜍上腭模型法考察藥物鼻纖毛毒性，優(yōu)點(diǎn)是與哺乳動(dòng)物鼻粘膜纖毛相似，且鏡下觀察較直觀，可同時(shí)觀察粘膜完整性、纖毛數(shù)量、纖毛脫落情況等形態(tài)學(xué)變化。但該法同時(shí)也存在不足之處:粘膜在分離時(shí)會(huì)破壞粘液層，忽視了粘液層對鼻纖毛的保護(hù)作用。應(yīng)用在體蟾蜍上腭模型法評價(jià)藥物的鼻粘膜纖毛毒性應(yīng)注意以下因素的影響:實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的體重會(huì)影響實(shí)驗(yàn)結(jié)果，體質(zhì)量較大動(dòng)物的纖毛擺動(dòng)時(shí)間是較小動(dòng)物的60% ～70%，故本實(shí)驗(yàn)選用體質(zhì)量為30～35g的中華大蟾蜍，以保證實(shí)驗(yàn)結(jié)果的準(zhǔn)確性;黏膜的位置，為保證黏膜與藥液充分接觸，本實(shí)驗(yàn)選取蟾蜍兩眼中間部位的上腭黏膜，該部位能完全被藥液浸沒，且可減少因粘膜部位不同帶來的差異性［3］。

通過對纖毛持續(xù)擺動(dòng)時(shí)間百分率和給藥后纖毛形態(tài)的評價(jià)，可以看出空白凝膠抑制作用相對較小，而磷酸川芎嗪溫敏凝膠對纖毛有一定毒性。文獻(xiàn)顯示，小分子化學(xué)合成藥物對纖毛運(yùn)動(dòng)的影響較為普遍［4］，也可能與磷酸川芎嗪溶液的酸度較大(pH值=3．26)、對粘膜有一定刺激性有關(guān)。

通過實(shí)驗(yàn)說明，本研究中所制備的磷酸川芎嗪溫敏凝膠對纖毛運(yùn)動(dòng)有一定的影響，需要進(jìn)一步包合才可以用于鼻腔給藥。

［1］ 林華慶，宋濤，王東凱，等．利巴韋林鼻用溫敏凝膠的鼻腔纖毛毒性研究［J］．中國新藥雜志，2007，16(16):1258－1260．

［2］ 田志發(fā)．鹽酸氯胺酮噴霧劑經(jīng)鼻黏膜吸收動(dòng)力學(xué)及纖毛毒性研究［J］．海峽藥學(xué)，2009，21(1):65－67．

［3］ 劉萊．氫溴酸右美沙芬鼻用熱敏凝膠的研究［D］．沈陽:沈陽藥科大學(xué)，2005:48－53．

［4］ 蔣新國，崔景斌，方曉玲，等．藥物的鼻粘膜纖毛毒性及評價(jià)方法［J］．藥學(xué)學(xué)報(bào)，1995，30(11):848－853．