黃樹明，任麗民，李健英，張博，范越

(1．黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥研究院，黑龍江 哈爾濱 150040;2．黑龍江中醫(yī)藥大學(xué)，黑龍江 哈爾濱 150040)

阿爾茨海默病(Alzheimers disease，AD)以記憶力減退、認(rèn)知障礙、性格改變?yōu)橹饕R床表現(xiàn)，其主要病理特征為腦內(nèi)淀粉樣蛋白(amyloid beta peptide，Aβ)沉積并形成不溶性的老年斑(senile plaque)?，F(xiàn)已明確，在老年斑形成之前小分子可溶性Aβ寡聚體就已對動物記憶的形成以及海馬長時程增強(qiáng)(long－term potentiation，LTP)產(chǎn)生抑制［1］，而海馬 LTP 的產(chǎn)生是記憶形成過程的關(guān)鍵環(huán)節(jié)。開心散始見于孫思邈的《備急千金要方》，由“遠(yuǎn)志、人參各四分，茯苓二兩，菖蒲一兩”組成，為益智健腦之代表方劑。研究發(fā)現(xiàn)，開心散可改善癡呆動物模型記憶力［2］。本實(shí)驗(yàn)采用活體動物海馬LTP的記錄，觀測在LTP被Aβ1－42抑制情況下，開心散的治療作用，以期闡明開心散改善AD患者記憶功能障礙的神經(jīng)生理學(xué)基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1．1 材料

1．1．1 動物分組

10周齡清潔級ICR小鼠，體質(zhì)量25～35g，雌雄不限，60只。隨機(jī)分為正常對照組、Aβ組和Aβ加開心散組。Aβ組及Aβ加開心散組動物側(cè)腦室注射Aβ，對照組注入等體積生理鹽水。于實(shí)驗(yàn)前2天給予Aβ加開心散組小鼠灌胃開心散0．3ml(含生藥量4g/ml)，每日1次，共計(jì)3天，空白對照組及Aβ組動物灌胃等體積生理鹽水。

1．1．2 實(shí)驗(yàn)儀器

小鼠腦立體定位儀(NARISHIGE);刺激電極(鎢制同軸金屬電極);玻璃記錄電極(內(nèi)充ACSF);放大器(DAM80);刺激裝置(NIHON KOHDEN);電刺激裝置(NIHON KOHDEN);數(shù)據(jù)獲取裝置(Molecular Device);動物恒溫系統(tǒng)(上海奧爾科特生物科技有限公司);跳臺實(shí)驗(yàn)裝置(中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥物研究所)。

1．2 方法

1．2．1 跳臺實(shí)驗(yàn)

將小鼠放于跳臺裝置的金屬柵上，適應(yīng)5min后，底部金屬柵通電，小鼠經(jīng)電擊便躲避并最后跳上安全臺。如此反復(fù)訓(xùn)練3次，記錄跳上安全臺的時間(跳上時間)。24h后將小鼠放在安全臺上，金屬柵通電，記錄小鼠第一次跳下平臺的時間(躲避時間)以及5min內(nèi)小鼠從臺上跳下的次數(shù)(錯誤次數(shù))。

1．2．2 海馬在體LTP記錄方法

小鼠腹腔注射戊巴比妥鈉(45mg/kg)麻醉后固定于腦立體定位儀上，切開頭部皮膚，暴露顱骨，在相應(yīng)的位置(Bregma后1mm，旁開1.75mm)用骨鉆在顱骨上鉆孔。微量進(jìn)樣器自腦表面垂直進(jìn)針，深度為硬腦膜下1．8mm，將濃度為1μm 的 Aβ1－42緩慢注入側(cè)腦室5μl，注射經(jīng)時10min，并留針10min以防液體外溢。實(shí)驗(yàn)過程中用電熱毯維持動物體溫于37℃。

突觸后電位的記錄選擇貫通纖維束(Perforant pathway)－齒狀核(dentate gyrus，DG)通路。刺激電極的尖端定位在海馬Perforant pathway側(cè)枝處，坐標(biāo)為Bregma后4．5mm、中線右側(cè)旁開3．0mm，深度為皮層下1.5～2．0mm;記錄電極尖端定位在DG區(qū)分子層，坐標(biāo)為Bregma后2．1mm、中線右側(cè)旁開1．5mm，深度為皮層下1．8～2．2mm;參考電極固定于后頭部皮膚表面。以波寬為0．6ms，頻率為0．067Hz的電刺激誘發(fā)并記錄fEPSP，待基礎(chǔ)記錄穩(wěn)定15min后，給予高頻刺激(High frequency stimuli，HFS)以誘發(fā) LTP(100Hz，1sce)，然后連續(xù)觀察記錄90min。LTP以fEPSP鋒電位(population spike)振幅增加的百分比表示。

1．3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

2 結(jié)果

2．1 Aβ及開心散對小鼠學(xué)習(xí)記憶功能影響的行為學(xué)檢測

通電后三組小鼠跳上安全臺的平均時間無明顯差異，即小鼠的基礎(chǔ)智力水平無差異。訓(xùn)練24h后，與正常對照組相比，Aβ側(cè)腦室注射小鼠的躲避時間明顯縮短，同時錯誤次數(shù)明顯增多，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理顯示兩個指標(biāo)在兩組間均存在顯著差異(P＜0．01)，證明側(cè)腦室注射Aβ可以引起動物記憶功能的損傷。Aβ加開心散組與單純Aβ組相比，動物在安全臺上的躲避時間明顯延長(P＜0．05)，同時誤走下跳臺的錯誤次數(shù)也大幅減少(P＜0．05)，提示口服開心散可以改善Aβ誘導(dǎo)的動物記憶功能損傷。如表1所示。

表1 開心散對Aβ誘導(dǎo)的小鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響(±s)

表1 開心散對Aβ誘導(dǎo)的小鼠學(xué)習(xí)記憶功能的影響(±s)

注:與對照組比較，*P ＜0．01;與 Aβ 組比較，#P ＜0．05。

7 16．29 ±11．98 277．71 ±58．96 0．29 ±0．48 Aβ 組 8 12．87 ±10．00 57．88 ±48．59*1．75 ±0．70*Aβ 加開心散組 9 15．56 ±12．58 182．00 ±123．18#0．78 ±0．83錯誤次數(shù)對照組組別 n跳上時間(s)躲避時間(s)#

2．2 側(cè)腦室注射 Aβ1－42及灌胃開心散對小鼠海馬LTP的影響

海馬LTP的形成是記憶形成過程的關(guān)鍵步驟，前面行為學(xué)結(jié)果顯示，側(cè)腦室注射Aβ可誘發(fā)動物學(xué)習(xí)記憶功能障礙，而灌胃開心散可以逆轉(zhuǎn)此狀況，提示開心散可改善Aβ使神經(jīng)細(xì)胞突觸傳遞LTP形成受到的抑制。因此用活體動物檢測了海馬LTP，結(jié)果表明，對照組、Aβ組及Aβ加開心散組小鼠海馬在給予高頻刺激HFS前的基礎(chǔ)刺激所誘發(fā)的EPSP波形并無差異。給予HFS后，在三組動物均觀察到LTP被誘發(fā)，表現(xiàn)為fEPSP波振幅和上升斜率增大。在HFS后90min時，對照組小鼠fEPSP鋒電位平均振幅比HFS刺激前增加(137．30±96．12)%，而Aβ組小鼠fEPSP鋒電位平均振幅增加(21．08±29．45)%，其增加幅度僅僅約為對照組的1/6，統(tǒng)計(jì)學(xué)處理顯示兩組間存在顯著性差異(P＜0．01)，提示Aβ通過抑制海馬神經(jīng)元突觸的可塑性功能而抑制了小鼠的記憶及功能。Aβ加開心散組小鼠的fEPSP鋒電位平均振幅比HFS前增加(93．93±74．11)%，約為單純 Aβ 組的4.5倍，兩組間存在顯著差異(P＜0．05)。提示開心散可逆轉(zhuǎn)Aβ對海馬神經(jīng)元突觸LTP形成的抑制，從而改善動物的記憶能力(見圖1)。

圖1 三組小鼠LTP比較

3 討論

AD以記憶力減退、認(rèn)知障礙、性格改變?yōu)橹饕R床表現(xiàn)。神經(jīng)病理學(xué)上表現(xiàn)為腦皮質(zhì)及海馬區(qū)Aβ沉積產(chǎn)生的老年斑和細(xì)胞骨架蛋白tau的高度磷酸化形成的神經(jīng)纖維纏結(jié)以及大腦皮層和海馬區(qū)突觸形態(tài)改變及神經(jīng)元丟失。其中Aβ的生成、代謝及其神經(jīng)毒性是AD發(fā)病的關(guān)鍵關(guān)節(jié)。研究證實(shí)，Aβ寡聚體是一種神經(jīng)毒素，可與神經(jīng)突觸結(jié)合并阻礙其功能，引起記憶丟失和相關(guān)的神經(jīng)損害。同時，電生理學(xué)研究證實(shí)，Aβ聚合成寡聚體后可直接對神經(jīng)突觸傳遞可塑性產(chǎn)生抑制［3］。Aβ寡聚體對海馬神經(jīng)元突觸信息傳遞LTP的抑制無疑是導(dǎo)致學(xué)習(xí)記憶功能障礙的關(guān)鍵環(huán)節(jié)［4－5］。

開心散具有開心益智之功。研究發(fā)現(xiàn)，開心散可以提高動物腦內(nèi)膽堿能神經(jīng)系統(tǒng)功能，提高AD動物模型學(xué)習(xí)記憶功能;可以增加腦組織中超氧化物歧化酶活性，清除體氧化物自由基，提高動物抗氧化應(yīng)激能力［4］。但是至今為止，開心散改善Aβ誘導(dǎo)的動物學(xué)習(xí)記憶功能低下的神經(jīng)生理學(xué)機(jī)制依然不清楚。研究表明，海馬神經(jīng)元突觸信息傳遞的LTP是記憶形成過程中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，因此本研究采用行為學(xué)及電生理學(xué)活體記錄的實(shí)驗(yàn)手段，探索了開心散改善AD病因蛋白Aβ誘導(dǎo)動物學(xué)習(xí)記憶功能障礙的的神經(jīng)生理學(xué)機(jī)制。

實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，側(cè)腦室注射Aβ1－42后，動物記憶功能明顯降低，同時其海馬神經(jīng)元突觸傳遞LTP亦明顯受到抑制，說明Aβ通過抑制海馬LTP這一機(jī)制誘發(fā)動物記憶形成障礙。而口服開心散后動物在學(xué)習(xí)記憶功能得到恢復(fù)的同時，海馬LTP也明顯改善。本研究結(jié)果表明，開心散改善AD模型動物學(xué)習(xí)記憶功能的神經(jīng)生理學(xué)機(jī)制是其阻斷了Aβ對中樞神經(jīng)突觸信息傳遞LTP的抑制。

［1］ Balducci C，Beeg M，Stravalaci M，et al．Synthetic amyloid－beta oligomers impair long－term memory independently of cellular prion protein［J］．Proc Natl Acad Sci USA，2010，107(5):2295－2300．

［2］ Nishiyama N，Zhou Y，Saito H．Ameliorative effects of chronic treatment using DX－9386，a traditional Chinese prescription，on learning performance and lipid peroxide content in senescence accelerated mouse［J］．Biol Pharm Bull，1994，17(11):1481－1484．

［3］ Walsh DM，Klyubin I，F(xiàn)adeeva JV，et al．Naturally secreted oligomers of amyloid beta protein potently inhibit hippocampal longterm potentiation in vivo［J］．Nature，2002，416(6880):535－539．

［4］ 溫薇，金在順，周敏，等．開心散影響突觸可塑性的研究進(jìn)展［J］．中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2010，38(2):140－141．

［5］ 李福東，王艷華，張超，等．開心散含藥腦脊液對無血清培養(yǎng)PC12細(xì)胞的促生長作用［J］．中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2012，40(6):12－14．