孫麗娟，付 群，李宏云，秦 超，馮永海

鄭州大學第五附屬醫(yī)院呼吸科鄭州450052

△女，1976年11月生，碩士，主治醫(yī)師，研究方向:分子生物學，E-mail:erhugege@163.com

肺癌的發(fā)病率和病死率呈逐年上升趨勢，其傳統(tǒng)的化療、放療方法和近年提出的腫瘤細胞免疫治療、放射免疫治療均給患者及社會帶來了極大的經濟負擔［1-2］。如何實現(xiàn)肺癌的個體化治療已逐漸成為腫瘤治療的新方向［3-4］。近年來出現(xiàn)的表皮生長因子受體(epidermal growth factor receptor，EGFR)酪氨酸激酶抑制劑(如吉非替尼、厄洛替尼)備受關注。研究［5］發(fā)現(xiàn)，吉非替尼對存在EGFR 基因突變的患者有較好的療效，但存在KRAS、BRAF、磷脂酰肌醇3 激酶(phosphoinositide 3-kinases，PI3K)基因突變的患者對吉非替尼表現(xiàn)出耐藥現(xiàn)象。所以，應盡早檢測患者癌基因突變情況，選擇正確的治療方案。分子標志物(靶標)檢測是個體化治療的前提。作者利用RT-PCR 技術檢測EGFR mRNA 的表達水平，并對吉非替尼治療效果差的患者檢測EGFR、KRAS、BRAF、PI3K 基因突變情況，為臨床靶向治療提供理論依據。

1 對象與方法

1.1 研究對象 收集2009年2月至2011年2月鄭州大學第五附屬醫(yī)院診治的經病理證實為非小細胞肺癌的患者80例，其中男46例，女34例，年齡28～75(56.8±10.7)歲。肺腺癌50例，鱗癌27例，腺鱗癌2例，大細胞癌1例。52例有吸煙史。腫瘤分期:Ⅲa 期32例，Ⅲb 期29例，Ⅳ期19例。病例入選標準:①病理證實為非小細胞肺癌的患者。②未接受任何相關治療。③愿接受靶向藥物治療。排除標準:①診斷不明確。②年齡＞75 歲。③小細胞肺癌。④曾接受靶向藥物治療。⑤合并有嚴重心、肝、腎臟器功能損害。

1.2 非小細胞肺癌患者腫瘤組織中EGFR mRNA表達量的RT-PCR 檢測 取冰凍腫瘤組織50 mg，按照試劑盒說明書的方法提取總RNA，逆轉錄為DNA。EGFR 及GAPDH 引物序列均由上海鼎國生物技術有限公司設計。EGFR 上游引物序列:5’-AACACAGTGGAGCGAATTCCTTT-3’，下 游引物序列:5’-GGAAGTCCATCGACATGTTGCT-3’，擴增產物大小153 bp。PCR 反應體系:10× PCR Buffer 2 μL，dNTP Mixture 0.8 μL，上游及下游引物各0.5 μL，cDNA 模板2 μL，Taq 酶0.2 μL，加RNase Free ddH2O 至20 μL。反應條件:94℃預變性1 min;94℃變性45 s，56℃退火45 s，72℃延伸1 min，共35個循環(huán);最后72℃延伸10 min。所有PCR 反應均設陰性對照。最終取PCR 產物10 μL 行瓊脂糖凝膠電泳，用圖像分析儀掃膠，以EGFR mRNA 和GAPDH 灰度值的比值表示EGFR mRNA 基因相對表達量。

1.3 吉非替尼的應用 選擇EGFR mRNA 高表達(即腫瘤組織EGFR mRNA 表達水平高于癌旁正常組織)的患者口服吉非替尼，250 mg/d，30 d 為1 療程，服用3 個療程后評價治療效果。

1.4 療效判定標準 按照實體瘤療效評價標準進行評估。對患者進行血、尿常規(guī)，肝腎功能，腫瘤標志物，心電圖，CT 及彩超等檢查，評價治療效果。

1.5 EGFR、KRAS、BRAF、PI3K 基因突變檢測取患者全血5 mL，放進抗凝管中，離心取血漿，4～8℃低溫保存。使用富集突變-液相芯片技術檢測EGFR、KRAS、BRAF、PI3K 基因突變情況(由廣州益善生物技術有限公司完成)。

1.6 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 17.0 進行分析，應用配對t 檢驗比較腫瘤患者癌組織和癌旁正常組織中EGFR mRNA 相對表達量的差異，應用Pearson 法分析不同療效患者EGFR、KRAS、BRAF、PI3K 基因突變檢測結果及療效與基因突變的相關性，檢驗水準α=0.05。

2 結果

2.1 EGFR mRNA 的表達 80例患者腫瘤組織EGFR mRNA 相對表達量為13.8±5.7，癌旁正常組織EGFR mRNA 相對表達量為1.2±0.4，差異有統(tǒng)計學意義(t=23.675，P ＜0.001)。其中65例患者EGFR mRNA 表達水平高于癌旁正常組織。

2.2 吉非替尼應用后的療效 65例EGFR mRNA高水平表達的患者口服吉非替尼3 個月，33例效果較好，表現(xiàn)為原發(fā)灶或轉移灶縮小，有效率50.8%。32例吉非替尼治療效果差，表現(xiàn)為原發(fā)灶或轉移灶進展。

2.3 不同療效患者EGFR、KRAS、BRAF、PI3K 基因突變檢測結果及療效與基因突變的關系 見表1。

表1 吉非替尼治療效果與EGFR、KRAS、BRAF、PI3K 基因突變的關系例

3 討論

EGFR 主要位于細胞膜，屬于受體酪氨酸激酶家族。目前，針對EGFR 的靶向藥物主要有兩類:①EGFR-TKI，如吉非替尼和厄洛替尼，通過抑制胞內區(qū)酪氨酸激酶的活性而發(fā)揮作用。②抗EGFR 單克隆抗體藥，如西妥昔單抗和帕尼單抗，通過與EGFR特異性配體競爭結合EGFR，阻斷依賴于配體的EGFR 活化。

臨床觀察［6］發(fā)現(xiàn)，EGFR-TKI 僅對10%～30%的患者有顯著療效，抗EGFR 單克隆抗體藥僅對10%～20%的患者有效。美國國家綜合癌癥網絡(NCCN)臨床實踐指南中推薦:非小細胞肺癌患者接受靶向藥物治療之前，應進行EGFR mRNA 表達水平檢測，確定是否給予靶向藥物治療。

KRAS 基因突變與非小細胞肺癌患者對EGFRTKI 靶向藥物的原發(fā)性耐藥有關［7-8］。NCCN 臨床實踐指南中明確指出:對于明確存在KRAS 基因突變的非小細胞肺癌患者，應考慮吉非替尼以外的藥物。

BRAF 基因定位于人染色體7q34，編碼具有絲氨酸/蘇氨酸蛋白激酶活性的Raf 蛋白。Raf 是EGFR 信號通路中KRAS 下游重要的信號分子，將信號從KRAS 傳導至MEK1/2，參與調控細胞的生物學事件。臨床研究［5］顯示，部分KRAS 基因未突變的非小細胞肺癌患者也會對EGFR 靶向藥物產生耐藥性，這主要是由于BRAF 基因存在突變而導致。

PI3K 是一組蛋白多聚體，其活化可產生多種生物學效應，包括調節(jié)細胞增殖、存活和細胞周期等。PI3K 基因的點突變可發(fā)生于多個外顯子，最常見的突變位點為外顯子9 和20。PI3K 突變會導致非小細胞肺癌患者對EGFR 靶向藥物不敏感［9］。

該研究顯示吉非替尼的療效與EGFR E18 和EGFR E19 基因突變呈正關聯(lián)，與EGFR E20、KRAS、BRAF、PI3K 基因突變呈負關聯(lián)。

綜上所述，對腫瘤患者進行靶向藥物治療前，行靶標檢測能夠科學預測治療效果，幫助患者選擇最佳治療方案。

［1］張毅，Michael Nishimura.腫瘤的細胞免疫治療［J］.鄭州大學學報:醫(yī)學版，2011，46(2):165

［2］關鋒，林秋玉，趙紅光，等.惡性腫瘤放射免疫治療的研究進展［J］.吉林大學學報:醫(yī)學版，2011，37(1):179

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