朱巧玲，冷佳奕，葉慶生

(華南師范大學生命科學學院，廣東省植物發(fā)育生物工程重點實驗室，廣東廣州510631)

石斛屬(Dendrobium)是蘭科中最大的屬之一，已被列入《瀕危野生動植物種國際貿(mào)易公約》(CITES)附錄中，全球約有1 500～1 600 種，是全球最具觀賞價值的四大蘭花之一. 我國特有的野生石斛都是春天開花的春石斛. 對金釵石斛、霍山石斛、鐵皮石斛等的光合作用、生長和栽培做過一些研究［1－4］，但對野生石斛的光合特性的研究缺乏系統(tǒng)性的研究.蘭科植物根據(jù)葉片的厚薄將蘭花分為厚葉蘭和薄葉蘭.一般認為，厚葉蘭屬CAM 植物，如蝴蝶蘭;薄葉蘭屬C3植物，如蘭屬植物，蘭科植物還未發(fā)現(xiàn)有C4類型［5－10］. 我國的野生石斛有70 多個種，分9個組［11］，其中大花石斛組(Sect. Eugenaanthe)最為豐富，占已有種的50%以上，有很好的觀賞價值和藥用價值.但關(guān)于我國野生石斛的光合途徑尚未有統(tǒng)一的定論.本文以大花石斛組的束花石斛和黃花石斛為材料，對它們的光合特性進行了系統(tǒng)研究，為石斛屬植物的資源保護和利用提供實驗依據(jù).

1 材料與方法

1.1 材料

實驗材料石斛采集自云南高黎貢山的野生種:大花組的束花石斛(D.chrysanthum)和黃花石斛(D.dixanthum)，用樹皮盆栽于遮陽率小于50%的塑料溫室大棚中，白天(30±2)℃，夜間(25±3)℃，濕度65～90%，每星期施用1 次3 倍稀釋的Hoagland 營養(yǎng)液.所有實驗測定均選取頂部向下的第4 片成熟葉片，3個重復.

1.2 實驗方法

1.2.1 葉片顯微結(jié)構(gòu)觀察 葉片解剖結(jié)構(gòu)采用光學顯微鏡觀察和掃描顯微鏡觀察.

1.2.2 葉綠素含量的測定 按WINTERMANS ＆DE MOTS［12］方法測定.

1.2.3 RuBPCase( EC 4.1.1.39) 、PEPCase( EC 4.1.1.31) 、GO( EC 1.1.3.1) 酶液提取和活性的測定 2 種石斛植株葉片各0.2 g 放入預冷的研缽中，加入1.5 mL 預冷的100 mmol /L Tris－ HCL 緩沖液(含10 mmol /L MgCl2、5 mmol/L 巰基乙醇，1 mmol/L EDTA，12.5% 甘油和1% 聚乙烯吡咯烷酮，pH 7.4)，迅速研磨，勻漿經(jīng)4 層紗布過濾后4 ℃下15 000 r/min 離心25 min，取上清液用于酶活性的測定.

RuBPCase、PEPCase 和GO 活性的測定按葉慶生［7］的方法測定.蛋白質(zhì)含量測定采用考馬斯亮藍法測定酶提取液中蛋白質(zhì)含量，以牛血清蛋白作標準曲線.

1.2.4 光合特性測定 用便攜式光合測定儀LI－6400(Li－Cor，USA)，同時測定凈光合速率(Pn)、氣孔阻力(Gs)、胞間CO2濃度(Ci)、蒸騰速率(Tr)、有效光輻射(PAR)、大氣溫度(Tair)等各種指標，3～9次重復，每次重復測定3～5 片，取平均值.

光響應曲線:測量時間為晴天上午9:30—11:30，利用LI－6400 自動光響應曲線測定功能，將LI－6400 內(nèi)置紅藍光源(6400－02B)在0～1 200 μmol/(m2·s1)設(shè)定一系列PAR 梯度分別測定對應梯度葉片Pn，將Pn和PAR 的成對值作出相應曲線，得到LCP、LSP 等相關(guān)參數(shù);將200 μmol/(m2·s1)以內(nèi)的PAR 和Pn的成對值進行直線回歸，求得Pn－PAR 響應曲線的初始斜率即為光合作用的AQY.測定時CO2濃度設(shè)為(380 ±10)μmol/mol，葉片溫度:(25 ±0.5)℃，相對濕度為(70 ±15)%.

CO2響應曲線:利用LI－6400 便攜式光合測定系統(tǒng)的注入系統(tǒng)(6400－01)設(shè)定CO2濃度，控制PAR 在(800 ±10)μmol/(m2·s)，溫度為(25 ±0.5)℃，RH:(70 ±15)%，在0～1 500 μmol/mol 范圍內(nèi)設(shè)定CO2濃度梯度，分別測定Pn，將Pn和PAR的成對值作出相應曲線，得到CCP、CSP 及相關(guān)參數(shù);將200 μmol/(m2·s)以內(nèi)的CO2濃度和Pn的對應值進行直線回歸，初始斜率即為RuBPCase 的CE.CO2光飽和點時的Pn為RuBP 再生速率.

溫度響應曲線:用LI－6400 便攜式光合測定系統(tǒng)的葉室調(diào)溫系統(tǒng)(6400－13)，在18～34 ℃溫度范圍內(nèi)，從低到高測定各溫度梯度的Pn值，測定時PAR 設(shè)為(800 ±10)μmol/(m2·s)，CO2濃度控制為(380 ±10)μmol/mol，相對濕度為(70 ±15)%左右.

凈光合速率Pn日變化和季節(jié)變化測定:日變化測定于5月中旬選擇3個晴天從7:00—19:00，每隔1 h 用LI－6400 便攜式光合測定系統(tǒng)測定Pn等光合作用相關(guān)參數(shù);季節(jié)變化于3—10月每月中旬選擇3個晴天，于10:00—11:00 在自然條件下用LI－6400 便攜式光合測定系統(tǒng)測定Pn等光合作用相關(guān)參數(shù).

1.2.5 葉綠素熒光參數(shù)日變化的測定 于5—7月選擇3個晴天，用德國WALZ 公司生產(chǎn)的PAM2100葉綠素熒光儀選取生長健康，長勢一致的石斛植株的功能葉片進行測定，每種植株測定3～5 片葉，每片葉選取1個圓形區(qū)域(area of interest. AOI，直徑1 cm)進行測定和統(tǒng)計. 葉綠素熒光參數(shù)分別為:Fv/Fm(PS II 最大原初光能轉(zhuǎn)換效率);Yield (PS II實際光化學效率);Fo(初始熒光強度)等，各數(shù)值及其對應的熒光圖像在飽和脈沖過程中被ImagingWin軟件實時記錄.

2 結(jié)果與討論

2.1 束花石斛、黃花石斛葉片的超微結(jié)構(gòu)

電鏡觀察發(fā)現(xiàn)束花石斛和黃花石斛葉肉組織內(nèi)的葉綠體內(nèi)淀粉顆粒等較多且大;葉片葉脈主脈發(fā)達，側(cè)脈細小. 橫切面上，葉脈維管束排列為圓環(huán)狀，葉脈的維管束鞘薄壁細胞較小，排列清晰，不含葉綠體，沒有花環(huán)型結(jié)構(gòu). 葉肉細胞中葉綠體數(shù)目較多.2 種石斛葉片解剖結(jié)構(gòu)表現(xiàn)出C3植物特征(圖1A、B).

圖1 束花石斛、黃花石斛葉片下表面掃描電鏡圖(A、B)和葉片橫切面石蠟切片圖(C、D)Figure 1 Electron microscope images of the lower surface (A，B)and paraffin section of cross－section (C，D)of D.chrysanthum and D.dixanthum

束花石斛和黃花石斛葉片都為背腹型葉，厚度約為300～400 μm，相對于蝴蝶蘭等厚葉蘭(CAM植物，葉片厚度約為3 000 μm)屬于薄葉蘭類型.葉片上表面無氣孔分布，有角質(zhì)層，葉片上表面細胞比較整齊分布，都呈近長方形排列.葉片下表面細胞均為不規(guī)則形狀，大小不等，氣孔分布于下表面(圖1C、D).2 種石斛葉片的氣孔密度比較高，大約達到97～123個/mm2，氣孔結(jié)構(gòu)為橢圓形，下陷，大小約為20～30 μm，上覆有蠟質(zhì)的氣孔蓋. 葉肉組織發(fā)達，分化為柵欄組織與海綿組織，但不是很明顯. 柵欄組織由1～2 層排列整齊的圓柱狀細胞構(gòu)成，厚約為60 μm，外層細胞排列緊密，染色較深，呈異細胞狀，內(nèi)層細胞染色較淺，含豐富的葉綠體;海綿組織細胞排列疏松，厚約40 μm 也含有較多的葉綠體.

2 種石斛葉片的氣孔密度較高，氣孔密度大，吸收CO2量多，有利于植物光合作用;有研究指出，氣孔密度、柵欄組織厚度與海綿厚度的比值與Pn值表現(xiàn)出一定的相關(guān)性［13－14］.石斛葉片表皮細胞排列緊密，葉肉柵欄組織發(fā)達，含有較多的葉綠體的結(jié)構(gòu)有利于它們在森林蔭蔽環(huán)境下的光合作用，是長期自然適應的結(jié)果.

2.2 束花石斛和黃花石斛光合速率(Pn)對光強、CO2 和溫度的響應

束花石斛、黃花石斛葉片的Pn－PAR 曲線呈相似的變化趨勢(圖2).PAR 為0～300 μmol/(m2·s)內(nèi)，隨著PAR 的增強，Pn呈線性迅速增大，PAR 為300～800 μmol/(m2·s)時，Pn增加趨緩.當PAR 為800 μmol/(m2·s)時，Pn達到最大，PAR 繼續(xù)增加，Pn則略有下降;2 種石斛蘭的最大光合速率(Pn)約6.0 μmol/(m2·s)左右，光補償點為5.0～8.0 μmol/(m2·s)，光飽和點在850～900 μmol/(m2·s)(表1).上述結(jié)果表明，石斛蘭的LSP 和LCP 相對低，具有陰生或半陰生植物的特點，這與其適于生長在較蔭處的生活習性相適應. 表觀量子效率(AQY)是葉片光能利用效率的一個重要指標，反映葉片對弱光的利用能力.2 種石斛蘭葉片的AQY 在0.022左右，表明束花石斛和黃花石斛的光能利用效率比較低，光合作用時對光量子要求較高，對弱光的利用潛能也比較大.

2 種石斛蘭的凈光合速率Pn對CO2濃度變化的響應也基本相同(圖2，表1)，CO2補償點(CCP)在80.00～90.00 μmol/mol;CO2濃度在0～700 μmol/mol 范圍內(nèi)，隨著CO2濃度的升高，Pn快速增加;當CO2濃度達到800 μmol/mol 左右時，Pn達到最大，約為8.0～10.0 μmol/(m2·s)，表明束花石斛、黃花石斛的CO2飽和點(CSP)在850～900 μmol/mol.2 種石斛蘭葉片的羧化效率分別為0.018 和0.022，即石斛蘭光合作用時每固定1個CO2分子需要的CO2分子數(shù)約為45～55，說明它們的羧化效率低，增加CO2濃度可以顯著提高它們的光合速率.

圖2 束花石斛和黃花石斛的光強、CO2 濃度和溫度響應曲線Figure 2 Response curves of light intensity，CO2 and temperature in the leaves of D.chrysanthum and D.dixanthum

表1 束花石斛和黃花石斛葉片的光響應特性和CO2 響應特性Table 1 Characteristics of light and CO2 responses of the leaves of D.chrysanthum and D.dixanthum

溫度是植物光合速率的主要影響因子. 束花石斛、黃花石斛的Pn在18～26 ℃范圍隨著溫度的升高而呈線性上升(圖2)，當溫度在26 ℃左右時，最大Pn在5.0～6.0 μmol/(m2·s)，當溫度超過30 ℃后，Pn隨著溫度的升高而下降. 這些結(jié)果表明石斛蘭的光合作用最適溫度約為26～30 ℃.這與霍山石斛、銅皮石斛的光合作用最適溫度在25～30 ℃的結(jié)果基本一致［15］.

2 種石斛蘭葉片的光飽和點到了最大日照強度(1 800～2 200 μmol/(m2·s1))的40%～50%，為半陰生植物特征.此外，2 種石斛葉片的羧化效率在0.02 左右，對低CO2濃度的利用率比較低.因此，增加CO2濃度可以提高它們的光合速率，有利于石斛蘭生長.溫度一方面通過影響Ci間接影響Pn，另一方面影響葉片內(nèi)光合作用相關(guān)酶的活性，每種植物的光合作用都有其能夠適應的溫度范圍與最適宜的溫度范圍［16－17］.本研究的2 種石斛蘭光合作用最適溫度在26～30 ℃之間，這表明它們適合在熱帶亞熱帶地區(qū)生長.

2.3 束花石斛和黃花石斛葉片的光合速率日變化特征

束花石斛和黃花石斛的凈光合速率Pn日變化都具有相同的變化趨勢，呈雙峰曲線(圖3)，從7:00 開始，Pn呈快速線性上升趨勢，11:00 左右光合速率達到最大，它們最大凈光合速率Pn在5.0～6.0 μmol/(m2·s)，隨后下降，13:00—14:00 達到最低點，表現(xiàn)出明顯的“光合午休”現(xiàn)象. 這是因為13:00—14:00，外界環(huán)境中的光強和溫度的不斷升高，超出2 種石斛光合作用的最高點，強光和高溫對植株的脅迫作用，導致氣孔關(guān)閉或部分關(guān)閉從而引起了“光合午休”現(xiàn)象的發(fā)生.14:00 以后，植物的光合速率又有所上升，15:00 左右出現(xiàn)Pn的第2個峰，但光合速率比上午的第1個峰要低得多，以后Pn快速下降.此外，繼續(xù)的測定表明，2 種石斛在夜間都沒有CO2吸收，這些表明束花石斛和黃花石斛不是CAM 植物而應該是C3光合途徑植物.

圖3 束花石斛和黃花石斛的凈光合速率、氣孔導度和蒸騰速率日變化Figure 3 Diurnal variation of Pn，Gs and Tr in the leaves of D.chrysanthum and D.dixanthum

2 種石斛光合速率日變化的“午休”現(xiàn)象，是環(huán)境條件和葉片的生理因素相互作用的綜合結(jié)果. 從外界環(huán)境的光強和溫度日變化情況看(圖3)，在7:00—11:00，Pn的增加和PAR、溫度呈正相關(guān)，11:00 以后光強和溫度的繼續(xù)上升超過了光合作用的最適條件，使得氣孔孔縮小或部分關(guān)閉從而使得氣孔阻力(Gs)增大、蒸騰速率(Tr)下降(圖3)，導致Pn下降，從而出現(xiàn)了“光合午休”現(xiàn)象.此現(xiàn)象實際上是植物的一種光保護機制，避免中午因過高的光強和溫度對植株光合機構(gòu)遭到破壞.2 種石斛的光合作用日變化特點與蘭屬植物的研究結(jié)果也是基本相似的［7－8］.

2.4 束花石斛、黃花石斛葉綠素熒光相關(guān)參數(shù)日變化

2 種石斛葉片的Fv/Fm日變化趨勢相似，全天基本呈“V”型(圖4). 早上7:00—11:00 隨著光照強度和氣溫的增加，F(xiàn)v/Fm逐漸下降，在13:00 下降到一天中的最小值.之后隨著光強和溫度的逐漸降低，F(xiàn)v/Fm值迅速回升.這表明石斛蘭光合作用的器官在中午光強和溫度較高下其光合活性受到了暫時的抑制，但光合器官并沒有受到損傷.

2 種石斛的Fo的日變化趨勢也基本一致，全天呈波動下降狀態(tài)(圖4).從早上7:00 開始，F(xiàn)o均呈緩慢下降趨勢，大約都在13:00 左右達到最低值，表明此時熱耗散增加［18－21］，但束花石斛15:00 左右又有一小的上升波峰，之后又趨于下降.這些結(jié)果均表明，2 種石斛葉片都可以通過增強非輻射能量耗散來消耗過剩的光能，從而使光合機構(gòu)免受破壞.

束花石斛、黃花石斛的Yield日變化在中午13:00 左右出現(xiàn)一低谷，之后又逐漸上升(圖4).Yield日變化幅度在0.35～0.65 之間變動.

葉綠素熒光參數(shù)可以反映光合機構(gòu)內(nèi)部一系列重要的調(diào)節(jié)過程. Fv/Fm的降低是判斷植物受光抑制的重要標準［19－22］，2 種石斛的Fv/Fm值變化呈“V”型，表明它們光合作用的器官的光合活性受到了暫時的抑制，但未受到損傷. Fo的日變化表明它們都可以通過增強非輻射能量耗散來消耗過剩的光能，從而使光合機構(gòu)免受破壞.

2.5 束花石斛、黃花石斛葉綠素含量和光合關(guān)鍵酶活性的變化

束花石斛、黃花石斛葉片總Chl 含量約為1.50 mg/g 左右，Chl(a/b)的比值在2.50～2.60 之間變化(表2).HOLDEN［23］廣泛地比較了C3植物和C4植物的葉綠素a/b 值，結(jié)果認為，C4植物比C3植物具有較高的葉綠素a/b 值，特別是在單子葉植物中，差別更為明顯，因為在單子葉C4植物維管束鞘細胞中葉綠體的葉綠素a/b 值比葉肉細胞高. C4植物甘蔗葉片的葉綠素a/b 值高達4 以上.石斛屬也是單子葉植物，2 種石斛葉片表現(xiàn)出典型的C3植物葉綠素Chl(a/b)比值特點.

圖4 束花石斛和黃花石斛葉綠素熒光相關(guān)參數(shù)日變化Figure 4 The daily curve of chlorophyll fluorescence parameters in D.chrysanthum and D.dixanthum

表2 束花石斛和黃花石斛葉綠素含量的變化Table 2 The chlorophyll content and ratio of leaves of D.chrysanthum and D.dixanthum

酶活性的測定結(jié)果表明(表3)，2 種石斛蘭的PEPCase 活性非常低，分別為1. 17 和1. 21 nmol/(mg·min). PEPCase 是C4和CAM 植物的主要標志酶之一，在C4植物甘蔗葉片中活性高達100 nmol/(mg·min)以上，而在C3植物中PEPCase 活性極低.這一研究結(jié)果與EDWARDS 等［24］的結(jié)果以及作者測定蘭屬植物的結(jié)果也是一致的［7－8］，說明2 種石斛應該是C3光合途徑植物，不太可能是C4和CAM 植物. 而它們都具有較高的RuBPCase 和GO 活性，說明它們是典型的C3光合途徑植物，且具有較高的光呼吸.

表3 束花石斛和黃花石斛葉片光合關(guān)鍵酶活性Table 3 The activities of key emzymes of phtotosynthesis in leaves of D.chrysanthum and D.dixanthum

2.6 束花石斛、黃花石斛光合速率的年變化

束花石斛、黃花石斛葉片的光合作用Pn季節(jié)變化規(guī)律比較相似(圖5)，呈單峰曲線，3月以后，Pn逐漸增加，6—7月Pn達到最高，9月以后緩慢下降，11月以后下降較快.2 種石斛在6—7月光合作用最強，這可能與這個季節(jié)環(huán)境溫度和光強都較為適合石斛的光合作用以及葉片的生長成熟等等因素有關(guān).1—2月和11—12月Pn值比較低，可能是因此段時間環(huán)境溫度、光強較低，且石斛蘭葉片尚在發(fā)育過程中，造成光合強度較低表現(xiàn)為Pn較低. 石斛蘭Pn季節(jié)變化總之5—8月是石斛蘭生長發(fā)育旺盛期.

圖5 束花石斛和黃花石斛凈光合速率年變化Figure 5 Pn Annual change of D. chrysanthum and D. dixanthum

總之，對束花石斛和黃花石斛葉片的結(jié)構(gòu)、光合特性、標志性酶活性等的研究結(jié)果表明:兩者屬于典型的C3植物.

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