張曉義 ，唐祝奇 ，劉 春 ，朱曉暉 ，印 彤 ，王粹芳 ，崔世維

（1南通大學(xué)附屬醫(yī)院內(nèi)分泌科，江蘇226001；2南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心）

糖尿病足(diabetic foot,DF)是指糖尿病患者合并神經(jīng)病變及周圍血管病變而導(dǎo)致下肢感染、潰瘍形成和(或)深部組織破壞[1]，是患者截肢致殘、死亡和日常生活能力喪失的重要原因[2]。近年來(lái)發(fā)病率明顯增加，越來(lái)越受到國(guó)內(nèi)外學(xué)者的關(guān)注[3]。糖尿病足防治的關(guān)鍵是預(yù)防[4]，約80%的糖尿病足最初起源是足部潰瘍，積極有效地處理足部潰瘍可極大地減少糖尿病足的形成和發(fā)展。足潰瘍的局部處理有多種方法，生物活性敷料覆蓋是可選擇的方法之一[5-6]。傳統(tǒng)醫(yī)學(xué)中有應(yīng)用蟾皮外敷治療各種無(wú)名腫毒與外傷創(chuàng)口的方法?，F(xiàn)代醫(yī)學(xué)研究證明，蟾皮中含吲哚堿、二烯羥酸內(nèi)酯等生物活性物質(zhì)[7-8]。本研究對(duì)糖尿病大鼠進(jìn)行皮膚潰瘍?cè)炷＃^察鮮蟾皮外敷增加血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)（vascular endothelial growth factor,VEGF）促進(jìn)潰瘍愈合的療效并探討作用機(jī)制。

1 材料與方法

1.1 材料 清潔級(jí)雄性SD大鼠42只，體重（210±10）g，南通大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供。實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK(蘇)2008-0010,實(shí)驗(yàn)動(dòng)物使用許可證：SYXK（蘇）2002-0022。飼養(yǎng)在SPF級(jí)屏障環(huán)境，飼喂無(wú)菌顆粒飼料（蘇州雙獅實(shí)驗(yàn)動(dòng)物飼料科技有限公司），其中碳水化合物 58.2%，脂肪 3.8%，蛋白質(zhì)18.3%,自由采食和飲水。

1.2 方法 （1）糖尿病大鼠皮膚潰瘍模型建立：大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)1周，隨機(jī)選取30只禁食12h（不禁水）。按65mg/kg劑量一次性腹腔注射經(jīng)稀釋的鏈脲佐菌素，即10g/L，pH4.4，100mg鏈脲佐菌素溶于10mL檸檬酸-檬酸鈉緩沖液（美國(guó)Sigma公司原裝進(jìn)口）。自由進(jìn)水，1周后出現(xiàn)多尿、多飲、體重下降，且隨機(jī)血糖在16.7mmoL/L以上者為造模成功。造模成功后繼續(xù)維持飼養(yǎng)，每周2次檢測(cè)血糖維持在16.7mmol/L以上。于第2周使用鹽酸戊巴比妥鈉（100mg/Kg）腹腔注射麻醉，將大鼠腰背兩側(cè)皮膚脫毛消毒，作長(zhǎng)1cm、深達(dá)淺筋膜的縱形切口，每日50%冰醋酸涂抹創(chuàng)面一次，持續(xù)1周，制備成缺損性皮膚潰瘍大鼠模型；創(chuàng)面無(wú)菌敷料覆蓋，單籠飼養(yǎng)。（2）動(dòng)物分組及干預(yù)：造模成功后的30只大鼠隨機(jī)分為糖尿病皮膚潰瘍?cè)炷＝M（15只）、糖尿病皮膚潰瘍治療組（15只）。正常對(duì)照組12只，腹腔一次性注射等體積不含STZ的檸檬酸-檬酸鈉緩沖液。治療組生理鹽水清洗潰瘍部位后，鮮蟾皮外敷并用醫(yī)用紗布固定；模型組僅用生理鹽水清洗潰瘍部位。（3）組織病理學(xué)檢查：第2、3周末大體觀察潰瘍創(chuàng)面，切取周圍2cm組織，10%甲醛固定，石蠟包埋切片。HE染色，光學(xué)顯微鏡觀察組織大體結(jié)構(gòu)。（4）免疫組織化學(xué)檢查：采用LAB VISION 2D全自動(dòng)免疫組化染色儀，EnVision二步法染色。所用一抗及ELIVISON試劑盒(PV-9000)和DAB酶底物顯色試劑盒購(gòu)自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司。觀察組織中血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子表達(dá)情況。采用酶聯(lián)免疫吸附反應(yīng)（ELISA）技術(shù)測(cè)定組織中VEGF含量。

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理 應(yīng)用Stata7.0統(tǒng)計(jì)軟件處理數(shù)據(jù)。計(jì)量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示，組間比較用方差分析，實(shí)驗(yàn)前后同組資料比較用配對(duì)t檢驗(yàn)，P＜0.05表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2．1 糖尿病大鼠模型建立 糖尿病造模一次成功29只大鼠，二次造模成功1只。大鼠隨機(jī)血糖高于16.7mmoL/L，活動(dòng)明顯下降，身體消瘦，毛發(fā)干枯、豎立，飲水量及尿量明顯增多。

2．2 實(shí)驗(yàn)大鼠皮膚潰瘍形態(tài)及組織病理觀察 各組在2周形成面積大小相似的潰瘍，其中（1）模型組3周潰瘍結(jié)痂創(chuàng)面縮??；2周表皮細(xì)胞有變性改變，細(xì)胞結(jié)構(gòu)不清，核濃縮，表皮和表皮下層結(jié)構(gòu)松散；3周表皮有小部分恢復(fù)，形態(tài)結(jié)構(gòu)與潰瘍2周基本相似；（2）治療組3周潰瘍結(jié)痂脫落，創(chuàng)面愈合。潰瘍3周時(shí)大鼠皮膚愈合良好，表皮層結(jié)構(gòu)基本恢復(fù)見(jiàn)圖1。（3）對(duì)照組皮膚表皮層細(xì)胞排列整齊，顆粒層清晰可見(jiàn)；真皮層皮膚附件結(jié)構(gòu)、形態(tài)良好。

2.3 創(chuàng)面組織VEGF表達(dá)與對(duì)照組比較 糖尿病大鼠創(chuàng)面組織VEGF含量降低；治療組VEGF含量2周時(shí)增高，但低于正常對(duì)照組，3周時(shí)表達(dá)下降（圖2）。

圖1 各組大鼠皮膚組織大體病理（100×）

圖2 各組大鼠皮膚潰瘍組織VEGF的表達(dá)（400×）

創(chuàng)面組織中VEGF的ELISA定量分析結(jié)果見(jiàn)表1。

表 1 創(chuàng)面組織第2、3周末VEGF的ELISA分析結(jié)果（只，±s）

表 1 創(chuàng)面組織第2、3周末VEGF的ELISA分析結(jié)果（只，±s）

與對(duì)照組比較，*P＜0.05；第 2 周末比較，#P＜0.05

組別 n 第2周末(μg/g) 第3周末(μg/g)對(duì)照組 12 48.3±4.2 45.6±3.4模型組 15 15.6±2.2* 10.9±2.7*#治療組 15 40.7±4.5* 19.5±3.2*#

3 討 論

隨著糖尿病患病率的上升，糖尿病相關(guān)的慢性創(chuàng)面越來(lái)越受到關(guān)注[9]。糖尿病皮膚潰瘍是其中較多見(jiàn)的一種，發(fā)病率高達(dá)15%，且由于機(jī)體長(zhǎng)期處于慢性高血糖壞境，導(dǎo)致創(chuàng)面無(wú)法得到有序而及時(shí)的修復(fù)。特點(diǎn)為愈合能力低，愈合延遲或不愈合，為臨床常見(jiàn)慢性難愈性創(chuàng)面[10-11]。本實(shí)驗(yàn)在糖尿病大鼠背部皮膚切開(kāi)后，持續(xù)化學(xué)刺激制備潰瘍模型，表現(xiàn)為創(chuàng)面正常組織結(jié)構(gòu)破壞、排列紊亂，符合糖尿病慢性創(chuàng)面的組織病理學(xué)特征。

臨床治療中改善糖尿病皮膚潰瘍局部微環(huán)境是治療關(guān)鍵[12-13]。基礎(chǔ)研究提示糖尿病皮膚潰瘍難愈與局部組織細(xì)胞外基質(zhì)沉積減少[14-15]，特別是內(nèi)皮細(xì)胞功能降低有關(guān)[16-18]。VEGF是參與血管化調(diào)控的主要生長(zhǎng)因子，可觸發(fā)一系列修復(fù)反應(yīng)，能有效促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞增殖及遷移，促進(jìn)新血管形成。糖尿病難愈創(chuàng)面VEGF不僅呈低水平表達(dá)，表達(dá)高峰持續(xù)時(shí)間也縮短，是創(chuàng)面難愈的重要原因之一[19]。本研究結(jié)果亦提示此點(diǎn)，遺憾的是未觀察微血管密度。

中醫(yī)有將蟾蜍入藥記載，目前蟾皮、蟾酥、干蟾均為國(guó)家藥典或衛(wèi)生部頒發(fā)的標(biāo)準(zhǔn)收載藥材，主要藥用活性成分有蟾蜍毒素類、蟾蜍配基類、蟾蜍色胺類等[20-21]。鮮蟾皮內(nèi)含蟾酥，具有解毒止痛之功效，某些蟾皮因子可促進(jìn)細(xì)胞移行、生存及傷口修復(fù)。本研究發(fā)現(xiàn)鮮蟾皮外敷可增加潰瘍創(chuàng)面VEGF表達(dá)水平及持續(xù)時(shí)間，促進(jìn)糖尿病大鼠皮膚潰瘍愈合，其臨床應(yīng)用效果值得研究。

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