李 凌

目前，對(duì)于RH(D)陰性等稀有血型的血液一般都采取冷凍保存的方式延長(zhǎng)血液保存期，以前都采用手工方法進(jìn)行保存和洗滌，手工方法因操作繁瑣，洗滌次數(shù)多，需要時(shí)間長(zhǎng)，常常延誤臨床患者的使用，而使用全自動(dòng)細(xì)胞處理系統(tǒng)(ACP215)克服了手工開放式洗滌制備方法操作步驟繁瑣、制備時(shí)間長(zhǎng)、工作效率低、人為因素影響多等缺點(diǎn)［1］。筆者近期對(duì)2 種方法制備冰凍解凍紅細(xì)胞進(jìn)行了初步的比較，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)告如下。

1 材料與方法

1.1 材料 試驗(yàn)用設(shè)備:－80℃低溫冰箱(日本三洋)，大容量離心機(jī)(Thermo 6000i)，37℃～40℃水浴箱(山東普華)，血細(xì)胞計(jì)數(shù)儀(Sysmex KX-21N)，分光光度儀(722)，無菌接管機(jī)(費(fèi)森尤斯)，全自動(dòng)細(xì)胞處理系統(tǒng)(ACP215)。試驗(yàn)用耗材及制劑:200 ml 使用甘油(規(guī)格160 ml，生產(chǎn)廠家:北京博德桑特輸采血器材科技開發(fā)中心)、600 mlPVC 轉(zhuǎn)移袋(北京博德桑特輸采血器材科技開發(fā)中心)、9%Nacl(規(guī)格80 ml，北京博德桑特輸采血器材科技開發(fā)中心)，0.9%Nacl(1 000 ml，四川南格爾生物醫(yī)學(xué)股份有限公司)，一次性甘油化耗材LN225(美國(guó)血液技術(shù)公司)、一次性去甘油化耗材LN235(美國(guó)血液技術(shù)公司)。

1.2 方法 血樣的采集和處理:來源本站血液管理科成品庫(kù)，使用CPDA-1 作保存液的全血，在2℃～6℃保存。50 袋隨機(jī)分成A、B 2 組，每組25 例。A 組作為對(duì)照組，使用手工方法制備，B 組作為試驗(yàn)組，使用ACP215 全自動(dòng)細(xì)胞處理系統(tǒng)制備。檢測(cè)紅細(xì)胞回收率、游離血紅蛋白及甘油含量。制備方法如下:

1.2.1 A 組( 對(duì)照組) 按手工法制備冰凍解凍紅細(xì)胞準(zhǔn)備:將200 ml 全血在離心機(jī)中離心(2 500 g ×12 min)后，按照規(guī)程，使用壓漿板去上層血漿及白膜層，獲得未甘油化的血液制劑。甘油化:將A 組紅細(xì)胞轉(zhuǎn)移至600 ml 深低溫冰凍袋中，用無菌接管機(jī)將冰凍袋導(dǎo)管和甘油連接，手工加入160 ml 低溫保護(hù)劑，加入同時(shí)，進(jìn)行搖晃，加入完畢，在室溫靜置30 min，將甘油化的紅細(xì)胞放入紙盒，放入－80℃專用冰箱冰凍保存。洗滌去甘油:把冰凍紅細(xì)胞從－80℃專用冰箱中取出，迅速放入37℃～40℃的水浴箱中，搖動(dòng)使血袋與水充分接觸，達(dá)到快速融化。根據(jù)手工洗滌操作規(guī)程，使用80 ml 9%Nacl溶液，2 000 ml 0.9%NaCl 溶液，離心6～7 次去上清進(jìn)行洗滌，洗滌完后，用0.9%NaCl 溶液懸浮紅細(xì)胞。2 組制備質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)［2］按照國(guó)家質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn):紅細(xì)胞回收率≥80%，游離血紅蛋白≤1 g/L，甘油含量≤10 g/L。測(cè)定方法［3］用細(xì)胞計(jì)數(shù)儀測(cè)定去甘油后產(chǎn)品，測(cè)得冰凍紅細(xì)胞準(zhǔn)備前后的紅細(xì)胞數(shù)量，并依此計(jì)算出紅細(xì)胞回收率;按照檢測(cè)規(guī)程用Trinder 法測(cè)定游離血紅蛋白。

1.2.2 B 組( 試驗(yàn)組) 將200 ml 全血在離心機(jī)中離心(2500 g×12 min)后，按照規(guī)程，使用壓漿板去上層血漿及白膜層，獲得未甘油化的血液制劑。甘油化使用B 組:將B 組紅細(xì)胞轉(zhuǎn)移至600 ml 深低溫冰凍袋中，用無菌接管機(jī)將冰凍袋導(dǎo)管和ACP215 全自動(dòng)細(xì)胞處理系統(tǒng)一次性甘油化耗材LN225 連接。ACP215 開機(jī)自檢后，選擇甘油化程序，將一次性甘油化耗材LN225 安裝好后，按開始鍵。處理機(jī)利用自動(dòng)將160 ml 低溫保護(hù)劑加入裝濃縮紅細(xì)胞的600 ml 血袋中，加入同時(shí)，機(jī)器全自動(dòng)搖床邊加邊振蕩，保證充分混合。機(jī)器自動(dòng)加入完畢后，在室溫靜置30 min，讓甘油充分滲入紅細(xì)胞中。靜置后，將甘油化的紅細(xì)胞平整地放入專用紙盒，再放入－80℃專用冰箱內(nèi)冰凍保存。解凍融化:把冰凍紅細(xì)胞從－80℃專用冰箱中取出，迅速放入37℃～40℃的水浴箱中，搖動(dòng)使血袋與水充分接觸，達(dá)到快速融化。洗滌去甘油融化后的紅細(xì)胞用無菌接管機(jī)與一次性去甘油耗材LN235 連接。ACP215 開機(jī)自檢后，選擇去甘油化程序，安裝好一次性去甘油化耗材及相應(yīng)的9%NaCl、0.9%NaCl 溶液后，按開始鍵，紅細(xì)胞處理儀按照設(shè)定程序進(jìn)行7 次洗滌。機(jī)器洗滌后，選用0.9%NaCl 溶液懸浮紅細(xì)胞。

2 結(jié)果

兩種方法準(zhǔn)備的冰凍解凍紅細(xì)胞的質(zhì)量指標(biāo)比較，見表1。

表1 兩種制備方法檢測(cè)指標(biāo)比較(±s)

表1 兩種制備方法檢測(cè)指標(biāo)比較(±s)

3 討論

冰凍紅細(xì)胞是借助冰凍保護(hù)劑(甘油)低溫保護(hù)的紅細(xì)胞。主要用于稀有血型和自身血長(zhǎng)期保存。臨床使用時(shí)需洗滌去甘油，經(jīng)過洗滌的解凍去甘油紅細(xì)胞去除了細(xì)胞的代謝產(chǎn)物及抗凝劑，減少了輸血中的不良反應(yīng)，是較為理想的血液制品［4-5］。使用時(shí)，將冰凍紅細(xì)胞復(fù)融，加一定量的洗脫液去除紅細(xì)胞內(nèi)外的幾乎所有甘油，再將紅細(xì)胞懸浮于一定量的0.9%NaCl 溶液中，便可供患者使用。影響冰凍解凍紅細(xì)胞的質(zhì)量指標(biāo)主要有紅細(xì)胞回收率、游離血紅蛋白濃度和甘油殘留量。從表1 可以看出，采用全自動(dòng)細(xì)胞處理系統(tǒng)保存，洗滌制備的冰凍解凍紅細(xì)胞其“紅細(xì)胞回收率”、“游離血紅蛋白濃度”和“甘油殘留量”與手工法相比經(jīng)統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，差異并無顯著性，均能達(dá)到國(guó)家標(biāo)準(zhǔn)。

使用全自動(dòng)系統(tǒng)洗滌冰凍解凍紅細(xì)胞，因具有很強(qiáng)的連續(xù)性，使得制備的冰凍解凍紅細(xì)胞僅需1 h 左右，而使用手工法制備因連續(xù)離心6～7 次，需要多人配合手工分離上清液，添加洗滌液，離心等許多不連續(xù)的步驟去完成，使得制備時(shí)間需5 h 左右，制備出的紅細(xì)胞必須在6 h 內(nèi)使用。由此可見，使用全自動(dòng)系統(tǒng)對(duì)臨床患者急救用血是十分有利的。

綜上所述，ACP215 細(xì)胞處理系統(tǒng)洗滌出的紅細(xì)胞完全能達(dá)到國(guó)家規(guī)定的要求，而且是全自動(dòng)完成所有步驟，其重復(fù)性高，不受操作人員手法影響，紅細(xì)胞是在全密閉系統(tǒng)中處理，減少了細(xì)菌污染的機(jī)會(huì)，延長(zhǎng)了去甘油紅細(xì)胞的保存時(shí)間，進(jìn)一步提供輸血的安全性。

［1］ 金志堅(jiān)，王擁軍.細(xì)胞洗滌機(jī)去甘油化技術(shù)的應(yīng)用［J］. 中國(guó)輸血雜志，2006，19，(1):55-56.

［2］ GB18469-2012，全血急成分血質(zhì)量要求［S］.

［3］ 中華人民共和國(guó)衛(wèi)生部. 血站技術(shù)操作規(guī)程(2012 版)［S］. 衛(wèi)醫(yī)政發(fā)［2012］1 號(hào)文件.

［4］ Lecak J，Scott K，Young C，et al.Evaluation of red blood cells stored at-80 degrees C in excess of 10 years［J］. Transfusion，2004，44(9):1306-1313.

［5］ Holovati JL，Wong KA，Webster JM，et al.The effects of cryopreservation on red blood cell microvesiculation，phosphatidylserine externalization and CD47 expression［J］. Transfusion，2008，48(8):1658-1668.