王 強(qiáng)，陳彥文，明海霞，高曉蘭，安彩萍

(1.甘肅中醫(yī)學(xué)院，甘肅 蘭州730000;2.甘肅省人民醫(yī)院，甘肅 蘭州730000)

二樣膏是甘肅中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院的院內(nèi)中藥制劑［1］，由止痛膏(批號(hào)為甘藥制字 Z04010876，由浙貝母、白芷、生大黃、木香、薄荷水、樟腦、冰片、麝香組成，具有消腫止痛、祛腐生肌功效，)與鐵箍膏(批號(hào)為甘藥制字Z04010877，由大青葉、乳香、大黃、膽礬、五倍子、沒藥、黃連、芙蓉葉、黃柏組成，具有消腫拔毒、止痛散結(jié)作用)按1∶1混合而成。省內(nèi)幾家醫(yī)院已有應(yīng)用鐵箍膏及止痛膏治療早期瘡瘍等疾病數(shù)十年的歷史。我們通過前期研究［2］證明：二樣膏的療效較單獨(dú)使用上述兩味藥顯著，未見有明顯的毒性、皮膚刺激性及過敏性，對(duì)金黃色葡萄球菌所致的體表軟組織感染具有明顯的抗炎作用，對(duì)IL-1α及TNF-α有顯著的影響，但其抗炎作用機(jī)制尚不明確。本實(shí)驗(yàn)旨在從免疫學(xué)角度對(duì)二樣膏的免疫調(diào)節(jié)機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料與方法

1.1 動(dòng) 物

健康SPF級(jí)小鼠，雌雄各半，體質(zhì)量(25±2)g，由甘肅中醫(yī)學(xué)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心提供，合格證號(hào)：SCXK(甘)2004-0006。

1.2 藥物、試劑與儀器

二樣膏由甘肅中醫(yī)學(xué)院附屬醫(yī)院藥劑科提供;環(huán)磷酰胺(CTX)，南京中標(biāo)晨曦化學(xué)技術(shù)有限公司產(chǎn)品，批號(hào)100234-201004;體積分?jǐn)?shù)5%雞紅細(xì)胞，由甘肅中醫(yī)學(xué)院基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)中心免疫學(xué)實(shí)驗(yàn)室提供;四噻唑鹽(MTT，又稱四甲基偶氮唑鹽)美國(guó)Sigma公司產(chǎn)品;二甲基亞砜(DMSO)，北京青鴻?？萍加邢薰井a(chǎn)品，批號(hào)67-68-5;植物血凝素(PHA)，上海市醫(yī)學(xué)化驗(yàn)所產(chǎn)品，批號(hào)0707;RPMI-1640細(xì)胞培養(yǎng)基，美國(guó) GiBco公司產(chǎn)品，批號(hào)1120708;芬蘭MK-3型酶標(biāo)儀，產(chǎn)地芬蘭;OLMPUS BX60-32FB2-A03型顯微鏡，上海富眾生物科技發(fā)展有限公司產(chǎn)品;XYJ80-2型電動(dòng)離心機(jī)，金壇市恒豐儀器廠產(chǎn)品。

1.3 動(dòng)物分組與給藥方法

將60只SPF級(jí)小鼠分成6組，每組10只，雌雄各半。正常對(duì)照組：生理鹽水灌胃5 mL/d，連續(xù)10 d。二樣膏低、高劑量組分別按10.5，42 g/kg劑量(分別相當(dāng)于人用量的5，20倍)二樣膏灌胃，1次/d，連續(xù)10 d。CTX組：實(shí)驗(yàn)當(dāng)天腹腔注射80μg/g CTX，同時(shí)生理鹽水0.5 mL/d灌胃，連續(xù)10 d。CTX+二樣膏低劑量組：實(shí)驗(yàn)當(dāng)天腹腔注射CTX 80μg/g，每天按10.5 g/kg二樣膏灌胃，連續(xù)10 d。CTX+二樣膏高劑量組：實(shí)驗(yàn)當(dāng)天腹腔注射80μg/g CTX，每天按42 g/kg二樣膏灌胃，連續(xù)10 d。

1.4 檢測(cè)指標(biāo)

1.4.1 胸腺指數(shù)與脾指數(shù)

頸椎脫臼處死小鼠，無菌狀態(tài)下解剖，取出胸腺和脾臟，用濾紙吸干血液后稱質(zhì)量，計(jì)算胸腺指數(shù)及脾指數(shù)。胸腺(脾)指數(shù)(mg/g)=胸腺(脾)質(zhì)量(mg)/小鼠體質(zhì)量(g)。

1.4.2 吞噬功能

參照文獻(xiàn)［3］方法進(jìn)行。第10天稱量各組小鼠體質(zhì)量;然后每只小鼠腹腔注射50 g/L淀粉肉湯1 mL致敏;24 h后，腹腔注射體積分?jǐn)?shù)為5%雞紅細(xì)胞懸液1 mL;4 h后脫臼處死小鼠，并在腹腔注入5 mL冷Hank液，按摩腹部5 min后，解剖小鼠;無菌吸取腹腔液涂片，晾干，甲醇固定5 min，瑞氏染色，鏡檢。在油鏡下觀察，隨機(jī)計(jì)數(shù)100個(gè)吞噬細(xì)胞中吞噬雞紅細(xì)胞及吞噬的雞紅細(xì)胞總數(shù)，并計(jì)算巨噬細(xì)胞吞噬百分率與吞噬指數(shù)。吞噬率(%)=(100個(gè)吞噬雞紅細(xì)胞的吞噬細(xì)胞數(shù)/100個(gè)吞噬細(xì)胞)×100%;吞噬指數(shù)=100個(gè)吞噬細(xì)胞中吞入的雞紅細(xì)胞數(shù)/100吞噬細(xì)胞。

1.4.3 T 細(xì)胞增殖反應(yīng)

MTT法［4］測(cè)定。無菌狀態(tài)下取脾臟制備小鼠脾細(xì)胞懸液，用RPMI-1640不完全營(yíng)養(yǎng)液洗滌3次;3000 r/min離心;用完全營(yíng)養(yǎng)液配成3.5×106mL;臺(tái)盼藍(lán)染色檢測(cè)細(xì)胞存活率＞95%;取100 mL加入96孔細(xì)胞培養(yǎng)內(nèi)(每孔含3.5×105個(gè)細(xì)胞，每個(gè)樣品做3個(gè)復(fù)孔);加入240 mg/L的PHA 20 mL(使終濃度為40 mg/L，同時(shí)設(shè)不加PHA對(duì)照孔)，置37℃、體積分積5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h;每孔加入MTT 10 mL(5 g/L)，培養(yǎng)4 h，離心，棄上清液;加入體積分?jǐn)?shù)30%DMSO 100 mL充分振蕩后靜置20 min;用酶標(biāo)儀于吸光度在0～0.7范圍、波長(zhǎng)570 nm處測(cè)OD值，結(jié)果以3個(gè)復(fù)孔的平均值±標(biāo)準(zhǔn)差表示。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 二樣膏對(duì)小鼠胸腺及脾臟的影響

CTX組小鼠的胸腺指數(shù)、脾指數(shù)均較正常對(duì)照組低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，表明造模成功。二樣膏高、低劑量組的胸腺指數(shù)、脾指數(shù)與正常對(duì)照組對(duì)比，差別無統(tǒng)計(jì)意義(P＞0.05)，表明二樣膏對(duì)免疫功能正常組小鼠沒有影響。二樣膏低劑量+CTX組、二樣膏高劑量+CTX組小鼠的胸腺指數(shù)、脾指數(shù)均較CTX組高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)，表明二樣膏對(duì)免疫功能低下組小鼠的胸腺指數(shù)、脾指數(shù)有影響并以高劑量影響較為顯著。見表1。

表1 各組小鼠胸腺指數(shù)及脾指數(shù)對(duì)比

2.2 二樣膏對(duì)小鼠巨噬細(xì)胞活性的影響

CTX組小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬百分率、吞噬指數(shù)均較正常對(duì)照組低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，表明造模成功。二樣膏高、低劑量組的兩指標(biāo)與正常對(duì)照組對(duì)比，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，表明二樣膏對(duì)免疫功能正常組小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬百分率、吞噬指數(shù)沒有影響。二樣膏低劑量+CTX組、二樣膏高劑量+CTX組的吞噬百分率、吞噬指數(shù)均較CTX組高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)，表明二樣膏對(duì)免疫功能低下組小鼠巨噬細(xì)胞的吞噬百分率、吞噬指數(shù)有影響，且以高劑量影響較為顯著。見表2。

表2 各組小鼠巨噬細(xì)胞吞噬百分率與吞噬指數(shù)對(duì)比

2.3 二樣膏對(duì)小鼠T淋細(xì)胞巴增殖的影響

CTX組小鼠T淋細(xì)胞巴增殖反應(yīng)能力較正常對(duì)照組低，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.01)，表明造模成功。二樣膏高、低劑量組的T淋細(xì)胞巴增殖反應(yīng)與正常對(duì)照組對(duì)比，差別無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，表明二樣膏對(duì)免疫功能正常組小鼠T淋細(xì)胞巴增殖反應(yīng)能力沒有影響。二樣膏低劑量+CTX組、二樣膏高劑量+CTX組的小鼠T淋細(xì)胞巴增殖反應(yīng)能力均較CTX組高，差別有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＜0.05或P＜0.01)，表明二樣膏對(duì)免疫功能低下組小鼠T淋細(xì)胞巴增殖反應(yīng)能力有影響并以高劑量影響較為顯著。見表3。

表3 各組小鼠T淋巴細(xì)胞增殖反應(yīng)對(duì)比

3 討論

中草藥對(duì)機(jī)體的免疫調(diào)節(jié)作用已有廣泛報(bào)道，如黃芪［5］具有對(duì)小鼠的細(xì)胞免疫、體液免疫和非特異性免疫的調(diào)節(jié)作用。胸腺、脾臟是周圍性免疫器官，其質(zhì)量的變化能反應(yīng)出機(jī)體的免疫功能。巨噬細(xì)胞為機(jī)體非特異性免疫細(xì)胞，在機(jī)體早期的抗感染中發(fā)揮重要作用。雞紅細(xì)胞相對(duì)小鼠是異體抗原物質(zhì)，將其注入小鼠腹腔可引起腹腔巨噬細(xì)胞聚集并吞噬雞紅細(xì)胞，這可作為機(jī)體非特異性免疫功能的重要指標(biāo)，可用其檢測(cè)藥物對(duì)機(jī)體防御能力的影響［6］。巨噬細(xì)胞是機(jī)體內(nèi)生物學(xué)作用最為活躍的細(xì)胞，具有吞噬、殺傷及消化病原體、殺傷腫瘤細(xì)胞、在特異性免疫應(yīng)答中參與抗原的提呈及免疫調(diào)節(jié)作用［7］。T淋巴細(xì)胞介導(dǎo)特異性細(xì)胞免疫并參與體液免疫應(yīng)答。機(jī)體抗腫瘤免疫效應(yīng)一般以細(xì)胞免疫為主［7］。

本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，二樣膏能提高免疫功能低下小鼠的胸腺指數(shù)和脾指數(shù)，增強(qiáng)小鼠腹腔吞噬細(xì)胞的吞噬功能，促進(jìn)T淋巴細(xì)胞增殖，且此免疫增強(qiáng)作用與藥物劑量間呈現(xiàn)一定的依存關(guān)系，在一定范圍內(nèi)隨藥物劑量增加而作用增強(qiáng)。此提示二樣膏有助于增加免疫功能低下小鼠的非特異性免疫功能。但二樣膏對(duì)于正常小鼠的免疫器官和非特異性免疫功能的影響不明顯。作為臨床上常見的體表如組織感染患者，其免疫功能一定有所下降，用該藥治療體表軟組織感染，應(yīng)該通過調(diào)節(jié)患者的非特異性免疫功能而發(fā)揮治療效果，以抵抗外來病原菌的侵襲。目前有關(guān)二樣膏對(duì)感染創(chuàng)面抗炎作用及其免疫機(jī)制尚未見報(bào)道，方中絕大部分中藥的抗炎機(jī)制研究還相對(duì)淺顯，尤其是細(xì)胞和分子水平的研究還較少;各藥物中抗炎成分間是否起到相互協(xié)同作用及如何作用并不清楚;此外，實(shí)驗(yàn)過程中有否存在誤差，有否排除非特異性應(yīng)激因素的影響等，都有待進(jìn)一步深入研究。

［1］甘肅省衛(wèi)生廳.醫(yī)院制劑手冊(cè)［M］.蘭州：甘肅人民出版社，1982：213-218

［2］王強(qiáng)，李應(yīng)東.二樣膏治療大鼠局部炎癥的實(shí)驗(yàn)研究［J］.遼寧中醫(yī)藥大學(xué)學(xué)報(bào)，2010，12(11)：54-56.

［3］魏偉.藥理實(shí)驗(yàn)方法學(xué)［M］.4版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2010：345-346.

［4］曾凡力，周敏，許敏，等.貴州老鷹茶提取物體外抗單純皰疹病毒1型活性的實(shí)驗(yàn)研究［J］.時(shí)珍國(guó)醫(yī)國(guó)藥，2011，22(2)：282-284.

［5］陳德宇，蘭偉.黃芪對(duì)小鼠機(jī)體免疫功能的增強(qiáng)作用［J］.細(xì)胞與分子免疫學(xué)雜志，2002，18(1)：52-53.

［6］王宇華.參萸保健酒對(duì)小鼠機(jī)體免疫功能的調(diào)節(jié)作用［J］.海峽藥學(xué)，2006，18(6)：38-40.

［7］金伯泉.醫(yī)學(xué)免疫學(xué)［M］.5版.北京：人民衛(wèi)生出版社，2008：132-133.