姚 宇，陳登庭，邢魯奇，鄧 淼

乳腺癌是威脅人類健康的常見惡性腫瘤之一。惡性腫瘤的發(fā)生、發(fā)展與機體的細(xì)胞免疫功能，尤其是T細(xì)胞各亞群的數(shù)量及其功能狀態(tài)密切相關(guān)[1]，近年來很多研究表明調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cells ,Tregs)在多種腫瘤的發(fā)生、發(fā)展、轉(zhuǎn)移過程中發(fā)揮免疫抑制作用。本研究采用免疫組化方法檢測腫瘤局部T淋巴細(xì)胞亞群的表達狀況，及其與乳腺癌臨床病理特征相關(guān)性，探討其對乳腺癌患者5 a生存率的影響。

1 材料與方法

1.1檢測對象選取河南科技大學(xué)第一附屬醫(yī)院病理科2001～2006年乳腺浸潤性導(dǎo)管癌病例80例，常規(guī)術(shù)后甲醛固定石蠟包埋。均為女性，年齡29～73歲，平均45.0歲。按2003年美國腫瘤聯(lián)合會(AJCC)乳腺癌TNM分期標(biāo)準(zhǔn)：Ⅰ期2例，Ⅱ期59例，Ⅲ期16例，Ⅳ期3例；組織學(xué)分級:高分化9例，中分化60例，低分化11例；手術(shù)病理證實淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移52例，無淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移28例；所有患者均進行了術(shù)后5 a隨訪，隨訪結(jié)果：死亡11例，存活69例，5 a生存率為86.3%。所有患者術(shù)前均未接受放、化療，全部標(biāo)本HE染色后均經(jīng)兩位有經(jīng)驗的病理醫(yī)師診斷。

1.2檢測方法所有標(biāo)本均經(jīng)4%甲醛固定，石蠟包埋，連續(xù)切片，厚度為4 μm，每例標(biāo)本切4張,染色時用已知陽性切片作陽性對照，用PBS代替一抗作陰性對照。小鼠抗人CD4單克隆抗體和小鼠抗人CD8單克隆抗體為即用型試劑，(福州邁新生物技術(shù)有限公司)；兔抗人FoxP3多克隆抗體(博奧森生物技術(shù)有限公司生產(chǎn))，染色結(jié)果用DAB顯色。

1.3結(jié)果判定FoxP3：陽性細(xì)胞著色定位于胞漿，CD4+和CD8+細(xì)胞著色定位于細(xì)胞膜，表現(xiàn)為淺黃、棕黃或棕褐色。用雙盲半定量法評估其染色，無陽性細(xì)胞數(shù)為(-)，陽性細(xì)胞數(shù)占腫瘤間質(zhì)淋巴細(xì)胞數(shù)<25%為(+)，25%～50%為(++)，>50%為(+++)。

1.3統(tǒng)計學(xué)分析所有數(shù)據(jù)均用SPSS 11.5 for Windows軟件包處理，按不同臨床病理指標(biāo)進行分組，生存率用Kaplan-Meier方法計算；各組間率的比較采用χ2檢驗；相關(guān)分析采用Spearman相關(guān)系數(shù)檢驗。

2 結(jié)果

2.1乳腺癌間質(zhì)T細(xì)胞亞群與患者5a生存率的相關(guān)性用Kaplan-Meier方法計算，F(xiàn)oxp3+Tregs陽性組和陰性組5 a生存率分別為92.5%和83.0%，兩者比較無顯著性差異(P>0.05)；CD4+T細(xì)胞陽性組和陰性組5 a生存率分別為73.7%和64.3%，兩者比較無顯著性差異(P>0.05)；CD8+T細(xì)胞陽性組和陰性組5 a生存率分別為25.0%和38.8%，兩者比較無顯著性差異(P>0.05)，見表1。

表1 乳腺癌間質(zhì)T細(xì)胞亞群活性與5 a生存率的相關(guān)性

2.2乳腺癌間質(zhì)Foxp3+Tregs浸潤與患者臨床病理特征的關(guān)系乳腺癌間質(zhì)中Foxp3+Tregs浸潤與pTNM分期、組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有顯著性差異(P<0.05)，與年齡、腫瘤大小無顯著性差異(P>0.05)，見表2。

表2 乳腺癌間質(zhì)Foxp3+Tregs的浸潤

2.3乳腺癌間質(zhì)CD4+T細(xì)胞浸潤與患者臨床病理特征的關(guān)系乳腺癌間質(zhì)中CD4+T細(xì)胞浸潤與pTNM分期、組織學(xué)分級、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移均有顯著性差異(P<0.05)，與年齡、腫瘤大小無顯著性差異(P>0.05)，見表3。

2.4乳腺癌間質(zhì)CD8+T細(xì)胞浸潤與患者臨床病理特征的關(guān)系腺癌間質(zhì)中CD8+T細(xì)胞浸潤與pTNM分期、組織學(xué)分級均有顯著性差異(P<0.05)，與淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移、年齡、腫瘤大小無顯著性差異(P>0.05)，見表4。

表3 乳腺癌間質(zhì)CD4+T細(xì)胞的浸潤

表4 乳腺癌間質(zhì)CD8+T細(xì)胞的浸潤

3 討論

在腫瘤局部微環(huán)境中，腫瘤細(xì)胞與T細(xì)胞相互誘導(dǎo)，相互抑制，若T細(xì)胞各亞群之間比例關(guān)系及功能出現(xiàn)異常，微環(huán)境內(nèi)免疫功能會受到抑制，最終將導(dǎo)致機體對腫瘤的免疫無能和腫瘤細(xì)胞的免疫逃逸[2]。這其中涉及多種調(diào)控因素，近幾年研究較多的是具有免疫負(fù)性調(diào)節(jié)作用的Tregs,表達在其胞核的叉頭翼狀螺旋轉(zhuǎn)錄因子(forkhead/winged helix transcription factor p3, Foxp3)在2001年由Brunkown等首次報道，目前被認(rèn)為是Tregs最具特異性的標(biāo)記物，且其在調(diào)節(jié)Tregs發(fā)育和功能方面起決定性的作用,是T淋巴細(xì)胞向免疫抑制功能定向分化的關(guān)鍵因素[3]。

T細(xì)胞是機體抵御腫瘤的主要力量，其中CD8+T細(xì)胞直接作為效應(yīng)細(xì)胞特異性殺傷癌細(xì)胞， CD4+T細(xì)胞主要通過分泌細(xì)胞因子調(diào)節(jié)機體抗腫瘤免疫狀態(tài)，二者皆處于免疫系統(tǒng)與腫瘤相互作用的前沿，若出現(xiàn)異常會直接影響機體抵御腫瘤的能力[4]。本研究發(fā)現(xiàn)乳腺癌間質(zhì)中Foxp3+Tregs的浸潤與組織學(xué)分化異常程度、pTNM分期及淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移的程度呈正相關(guān)，而CD4+及 CD8+T細(xì)胞在乳腺癌間質(zhì)的浸潤與這些臨床病理特征呈負(fù)相關(guān)，但這些腫瘤間質(zhì)T淋巴細(xì)胞的浸潤與患者的年齡和腫瘤大小無相關(guān)性。可提示乳腺癌間質(zhì)Foxp3+Tregs可促進淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，在患者病情進展過程中發(fā)揮積極作用，它的增多可能抑制了在機體免疫系統(tǒng)中發(fā)揮重要功能的CD4+和CD8+T細(xì)胞，打破腫瘤間質(zhì)免疫平衡狀態(tài)，致使腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸，從而參與腫瘤的擴散和轉(zhuǎn)移。Liyanage等對胰腺癌腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞和局部淋巴結(jié)中Treg細(xì)胞研究發(fā)現(xiàn)，Treg細(xì)胞數(shù)量在腫瘤局部顯著增多[5]。有研究表明，在卵巢癌患者中發(fā)現(xiàn)Treg細(xì)胞可抑制CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞及NK細(xì)胞的抗瘤活性。有學(xué)者認(rèn)為，F(xiàn)oxp3+Tregs可通過多種途徑抑制間質(zhì)T細(xì)胞亞群的免疫功能，通過抑制CD4+和CD8+T細(xì)胞IL-2基因的轉(zhuǎn)錄和表達來抑制T淋巴細(xì)胞的活化、增殖[6]，亦能通過下調(diào)樹突狀細(xì)胞的CD80和CD86共同刺激分子表達、抑制樹突狀細(xì)胞成熟和上調(diào)穿孔素和顆粒酶的表達，有選擇性地殺傷提呈抗原的B細(xì)胞，抑制B細(xì)胞的增殖，從而影響抗原的提呈，致使腫瘤局部免疫無能，腫瘤細(xì)胞發(fā)生免疫逃逸，患者病情加重出現(xiàn)腫瘤擴散甚至轉(zhuǎn)移[7-8]。這些論斷與本實驗結(jié)果相似，提示Foxp3+Tregs在乳腺癌發(fā)生、發(fā)展的過程中發(fā)揮重要作用，可以作為評估患者病情程度的一個參考指標(biāo)或者是治療中的一個針對點。本研究還發(fā)現(xiàn)，5 a存活陰性組患者的腫瘤間質(zhì)T淋巴細(xì)胞亞群與5 a存活陽性組患者的相比較,差異并無顯著性，這提示了雖然乳腺癌間質(zhì)T淋巴細(xì)胞亞群平衡狀態(tài)的改變使得腫瘤間質(zhì)出現(xiàn)免疫抑制，造成腫瘤細(xì)胞對機體免疫系統(tǒng)的耐受和免疫逃逸，促進腫瘤的浸潤進展和淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移，但與乳腺癌患者5 a生存并無明顯相關(guān)性。對于這一研究結(jié)果，我們可認(rèn)為，對乳腺癌患者預(yù)后有影響的因素有多種，間質(zhì)T細(xì)胞亞群只是對其有重要影響的因素之一，故還需進一步的實驗和研究。

近年來，免疫治療腫瘤已成為醫(yī)學(xué)界關(guān)注的熱點之一，一些腫瘤浸潤淋巴細(xì)胞過繼免疫治療和腫瘤疫苗已通過大量實驗，但效果并不理想，其中有很多需要解決的問題[9-10]。本研究提示，乳腺癌間質(zhì)T細(xì)胞亞群與腫瘤細(xì)胞的相互影響、相互抑制直接關(guān)系著患者病情的發(fā)展，對間質(zhì)T細(xì)胞亞群的研究，或許可以為對抗惡性腫瘤提供新的途徑。

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