★ 李養(yǎng)學(xué) 譚志燦 李素梅 江潔怡 程青云 彭麗詩 (.廣東省中醫(yī)研究所 廣州50095;.廣州中醫(yī)藥大學(xué) 廣州50405)

復(fù)方歸芍膠囊是廣東省第二中醫(yī)院醫(yī)院制劑，由當(dāng)歸、白芍、黃芪、白術(shù)、柴胡、延胡索、阿膠、茯苓等藥物組成，具有氣血雙補(bǔ)、調(diào)經(jīng)止痛、健脾利濕的功效，在臨床上用于治療氣血不足、脾不統(tǒng)血之月經(jīng)不調(diào)、痛經(jīng)等癥。為了更好地控制其內(nèi)在質(zhì)量，保證臨床療效，本文采用薄層色譜法對方中當(dāng)歸、白芍、黃芪和柴胡進(jìn)行了定性鑒別，采用高效液相色譜法對方中阿魏酸的含量進(jìn)行了測定。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

Agilent 1200 高效液相色譜儀(美國);Camag Automatic TLC Sampler 4 全自動薄層點(diǎn)樣儀(瑞士);Camag Reprostar 3 薄層成像系統(tǒng)(瑞士);KQ5200DE 型數(shù)控超聲波清洗器(昆山);PBQ － II型薄層自動鋪板器(重慶);DHG －9070A 電熱恒溫干燥箱(上海);Sartorius BP211D 分析天平(德國);HWS－26 電熱恒溫水浴鍋(上海)。

1.2 試藥

當(dāng)歸對照藥材(批號:120927 －201014)、白芍對照藥材(批號:120905 －200508)、黃芪對照藥材(批號:120974 － 200508)、柴胡對照藥材(批號:120992 －200504)、阿魏酸對照品(批號:110773 －200611)均購于中國藥品生物制品檢定所;復(fù)方歸芍膠囊(批號:120801、120802、120803)由廣東省第二中醫(yī)院制劑室提供;乙腈為色譜純，水為雙蒸水;其余均為分析純。

2 定性鑒別［1－4］

2.1 當(dāng)歸TLC 鑒別

取本品內(nèi)容物5g，加1%碳酸氫鈉溶液50mL，超聲處理20 分鐘，離心，取上清液，用稀鹽酸調(diào)節(jié)pH 值至2 －3，用乙醚振搖提取2 次，每次20mL，合并乙醚液，揮干，殘?jiān)蛹状?mL 使溶解，作為供試品溶液。另取當(dāng)歸對照藥材2g，同法制成對照藥材溶液。再取缺當(dāng)歸的陰性樣品5g，同供試品溶液制備方法制成當(dāng)歸陰性對照溶液。照薄層色譜法(《中國藥典》2010 年版一部附錄VIB)試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各10μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以環(huán)己烷三氯甲烷－乙酸乙酯－甲酸(4∶1∶1∶0.1)為展開劑，展開，取出，晾干，置紫外光燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的熒光斑點(diǎn)，陰性對照無干擾(見圖1)。

圖1 當(dāng)歸TLC 圖

2.2 白芍TLC 鑒別

取本品內(nèi)容物5g，加乙醇50mL，超聲處理30分鐘，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)铀?mL，微熱使溶解，放冷，通過D101 型大孔吸附樹脂柱(內(nèi)徑為1.5cm，柱高為12cm)，以水50mL 洗脫，棄去水液，再用20%乙醇50mL 洗脫，收集洗脫液，蒸干，殘?jiān)右掖糽mL 使溶解，作為供試品溶液。另取白芍對照藥材0.5g，加乙醇10mL，超聲處理5 分鐘，濾過，濾液蒸干，殘?jiān)右掖糽mL 使溶解，作為對照藥材溶液。再取缺白芍的陰性樣品5g，同供試品溶液制備方法制成白芍陰性對照溶液。照薄層色譜法(附錄ⅥB)試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各10μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷－乙酸乙酯－甲醇－甲酸(40∶5∶10∶0.2)為展開劑，展開，取出，晾干，噴以5%香草醛硫酸溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對照無干擾(見圖2)。

圖2 白芍TLC 圖

2.3 黃芪TLC 鑒別

取本品內(nèi)容物10g，加水50mL，加熱回流30 分鐘，濾過，濾液用水飽和的正丁醇振搖提取2 次，每次40mL，合并正丁醇液，用氨試液充分洗滌2 次，每次40mL，棄去氨液，正丁醇液蒸干，殘?jiān)蛹状?mL使溶解，作為供試品溶液。另取黃芪對照藥材3g，同法制成對照藥材溶液。再取缺黃芪的陰性樣品10g，同供試品溶液制備方法制成黃芪陰性對照溶液。照薄層色譜法(附錄ⅥB)試驗(yàn)，吸取上述3 種溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G 薄層板上，以三氯甲烷－甲醇－水(13:7:2)的下層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以10%硫酸乙醇溶液，在105℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對照無干擾(見圖3)。

2.4 柴胡TLC 鑒別

取“2.3”項(xiàng)下供試品溶液作為供試品溶液。另取柴胡對照藥材1g，同法制成對照藥材溶液。再取缺柴胡的陰性樣品10g，同供試品溶液制備方法制成柴胡陰性對照溶液。照薄層色譜法(附錄ⅥB)試驗(yàn)，吸取上述三種溶液各5μL，分別點(diǎn)于同一硅膠G薄層板上，以正丁醇－乙酸乙酯－稀氨水(1→10)(4∶1∶5)的上層溶液為展開劑，展開，取出，晾干，噴以2%對二甲氨基苯甲醛的40%硫酸溶液，在60℃加熱至斑點(diǎn)顯色清晰，分別置日光和置紫外光燈(365nm)下檢視。供試品色譜中，在與對照藥材色譜相應(yīng)的位置上，顯相同顏色的斑點(diǎn)，陰性對照無干擾(見圖4)。

圖3 黃芪TLC 圖;

圖4 柴胡TLC 圖

3 阿魏酸含量測定［1，5］

3.1 色譜條件

色譜柱:Agilent Extend C18(4.6 ×250mm，5μm)柱;流動相:以甲醇為流動相A，以1%醋酸溶液為流動相B，按表1 中的規(guī)定進(jìn)行梯度洗脫;流速為1.0mL/分;檢測波長為316nm;柱溫為35℃。

表1 流動相梯度

3.2 對照品溶液的制備

取阿魏酸對照品適量，精密稱定，置棕色量瓶中，加70%甲醇制成每1mL 含10.50μg 的溶液，即得。

3.3 供試品溶液的制備

取本品內(nèi)容物3g，精密稱定，置具塞錐形瓶中，精密加入70%甲醇20mL，密塞，稱定重量，加熱回流30 分鐘，放冷，再稱定重量，用70%甲醇補(bǔ)足減失的重量，搖勻，靜置，取上清液濾過，取續(xù)濾液，即得。

3.4 當(dāng)歸陰性對照溶液的制備

取當(dāng)歸陰性對照樣品，按照“3.3”項(xiàng)下方法制備陰性對照溶液。

3.5 空白試驗(yàn)

分別精密吸取上述溶液各10μL，注入液相色譜儀，在上述色譜條件下測定。結(jié)果陰性對照溶液色譜在對照品色譜相應(yīng)的位置上，無其他色譜峰干擾，說明該方法專屬性較好(見圖5)。

3.6 線性關(guān)系考察

精密稱取阿魏酸對照品適量，加70%甲醇溶解制成每1mL 含阿魏酸25.06μg 的溶液，分別精密移取1、2、3、4、5、6mL 于10mL 量瓶中，加70%甲醇稀釋至刻度。精密吸取各濃度對照品溶液10μL，注入液相色譜儀，測定，記錄峰面積，以阿魏酸的進(jìn)樣量為橫坐標(biāo)X，以色譜峰面積為縱坐標(biāo)Y，計(jì)算回歸方程，結(jié)果表明阿魏酸在25.06 ～150.36ng 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，其回歸方程為:Y =6.3353X －6.6305，相關(guān)系數(shù)r=0.99999。

圖5 阿魏酸HPLC 圖

3.7 精密度試驗(yàn)

精密吸取阿魏酸對照品溶液(10. 50μg/mL)10μL，連續(xù)進(jìn)樣6 次，其峰面積平均值為680.4381，RSD 為0.38%，表明儀器精密度良好(見表2)。

表2 精密度試驗(yàn)結(jié)果(n=6)

3.8 穩(wěn)定性試驗(yàn)

取本品內(nèi)容物(批號:120801)3g，精密稱定，按“3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別于0，2，4，8，12 小時，18 小時進(jìn)樣10μL，測得其峰面積RSD 為0.43%，表明供試品溶液在18 小時內(nèi)穩(wěn)定(見表3)。

表3 穩(wěn)定性試驗(yàn)結(jié)果(n=5)

3.9 重復(fù)性試驗(yàn)

取同一批次樣品(批號:120801)，分別精密稱取6 份，按“3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法測定，計(jì)算阿魏酸的平均含量為0.0645mg/g，RSD 為0.68%，結(jié)果表明本方法有較好的重復(fù)性(見表4)。

表4 樣品重現(xiàn)性試驗(yàn)(n=6)

3.10 加樣回收率試驗(yàn)

取已知含量(0. 0643mg/g)的樣品(批號:120801)6 份，每份約1.5g，精密稱定，分別精密加入一定量的阿魏酸對照品，按“3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，依法測定，計(jì)算平均回收率為98.46%，RSD 為1.85%。結(jié)果表明:回收率較好，此方法可行(見表5)。

表5 加樣回收率試驗(yàn)結(jié)果

3.11 含量測定

分別 取3 批 樣 品(批 號:120801、120802、120803)，按“3.3”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，分別測定阿魏酸的含量，計(jì)算結(jié)果(見表6)。

表6 樣品含量測定結(jié)果

4 討論

4.1 對方中白芍進(jìn)行薄層鑒別時，采用藥典方法展開效果不佳。嘗試多種方法后，最終采用D101 型大孔吸附樹脂柱純化樣品，結(jié)果斑點(diǎn)清晰，分離效果好。

4.2 對方中柴胡進(jìn)行薄層鑒別時，曾嘗試多種制備方法及不同展開系統(tǒng)，最終采用文中所述方法，結(jié)果薄層色譜斑點(diǎn)清晰，分離度較好。

4.3 在阿魏酸的含量測定過程中，經(jīng)過多次試驗(yàn)，最終采用甲醇－1%醋酸溶液為流動相進(jìn)行梯度洗脫，結(jié)果分離度較理想，阿魏酸峰形較好。另外，分別考察了提取方法，提取時間和提取溶劑等因素，結(jié)果以20mL 70%甲醇為提取溶劑，加熱回流30 分鐘，提取效果較佳。

5 結(jié)論

本文所建立的TLC 方法能準(zhǔn)確、快速地鑒別方中所含當(dāng)歸、白芍、黃芪和柴胡，其TLC 特征斑點(diǎn)清晰，分離度好，陰性對照均無干擾;阿魏酸的HPLC含量測定方法操作簡單，準(zhǔn)確可靠，重現(xiàn)性好。上述方法可作為復(fù)方歸芍膠囊的質(zhì)量控制方法。

［1］國家藥典委員會.中華人民共和國藥典2010 年版(一部)［S］.北京:中國醫(yī)藥科技出版社，2010:96，124，263，283.

［2］蘇克劍，孫黎，黃旭彬，等.肝八味膠囊的薄層定性鑒別［J］.中國醫(yī)院藥學(xué)雜志，2008，28(11):932 －933.

［3］賀銀梅，李赟，夏繼偉.柴術(shù)乳康膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究［J］. 內(nèi)蒙古中醫(yī)藥，2008，27(11):102.

［4］涂瑤生，畢曉黎.益腎康膠囊質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的研究［J］.中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2006，12(8):16 －18.

［5］賀云彪，劉軍，伍良知.高效液相色譜法測定當(dāng)歸養(yǎng)血丸中阿魏酸含量［J］.中國現(xiàn)代藥物應(yīng)用，2010，4(16):15 －16.