陳乃富，谷仿麗，陳乃東，戴 軍

蕨菜是采自蕨科蕨屬中蕨(Pteridium aquilinum L.)的幼嫩葉，已有研究表明蕨菜乙醇提取物中黃酮類化合物含量較高，可達干蕨菜粉的7.28%［1］，且具有抗氧化、調節(jié)血脂等作用［1－4］。但目前關于該提取物的致突變研究未見報道。為此，我們用改良的Ames試驗對蕨菜乙醇提取物的致突變進行研究，以判斷其是否具有致突變作用，為蕨菜的開發(fā)利用提供一定的試驗依據。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 儀器 旋轉式蒸發(fā)器、TU1201分光光度計、高速冷凍離心機、液氮罐、高壓滅菌鍋、振蕩培養(yǎng)箱、恒溫培養(yǎng)箱、電子天平、微量注射器、常用接種工具、培養(yǎng)皿及常用玻璃儀器。

1.1.2 試劑 牛肉膏、混合蛋白胨、D－生物素、L－組氨酸、氨芐青霉素、結晶紫、四環(huán)素、二甲基亞砜(DMSO)、輔酶 －Ⅱ、葡萄糖 －6－磷酸鈉鹽、玉米油、敵克松(Dexon)、2－乙酰氨基芴(2－AF)及相關常用試劑等。

1.1.3 受試物 蕨菜乙醇提取物，本實驗室自制，冰箱冷藏。

1.1.4 菌株 鼠傷寒沙門氏菌突變型菌株TA97、TA98、TA100、TA102由安徽醫(yī)科大學毒理學實驗室提供。因突變型菌的某些特性易丟失或變異，因此，在使用前按照文獻［5］中方法進行鑒定，4種菌株鑒定結果均合格。

1.2 實驗方法

1.2.1 受試物的制備和組氨酸含量測定 ①受試物的制備:蕨菜干粉經乙醚脫脂后，用70%乙醇、80℃、料液比1:15提取兩次，合并濾液，回收乙醇，得深褐色漿狀物。②受試物中組氨酸含量測定:本實驗所用菌株為組氨酸缺陷型，要求根據受試物系中是否含組氨酸來確定是否設定組氨酸對照組。按照文獻［6］方法測得受試物中不含組氨酸量，因此，本實驗無需設組氨酸對照組。

1.2.2 活化系統(tǒng)(S9和 S9混合液)的制備［7－8］①大鼠肝S9的誘導和制備:健康雄性SD大鼠，體重150 g左右，鼠齡約5～6周。將β－萘黃酮、注射用苯巴比妥鈉溶于玉米油中，濃度為200 mg·mL－1，按500 mg·kg－11次腹腔注射，5天后斷頭處死動物，取出肝臟，濾紙吸干表面液體，稱重后，用新鮮冰冷的0.15 mol/L氯化鉀溶液連續(xù)沖洗肝臟數次，每1 g肝(濕重)加0.1 mol/L氯化鉀溶液3 mL，連同燒杯移入冰浴中，用消毒剪刀剪碎肝臟，組織勻漿器(20 000 r/min，1 min)中制成肝勻漿。以上操作均在無菌和局部低溫環(huán)境中進行。將制成的肝勻漿在低溫(0～4℃)高速離心機上以12 000 r/min離心10 min，吸出上清液為S9組分，分裝后液氮保存。②S9肝液中的蛋白含量測定:根據Lowry法測S9肝液中的蛋白含量。將①制備中S9肝液稀釋100倍后測定其蛋白質含量為0.111 mg/mL，符合實驗要求［5］。③10%S9混合液由S9液和輔助因子(S9混合液試劑)組成。

1.2.3 鼠傷寒沙門氏菌回復突變試驗(Ames試驗)(平板滲入法)［5］①分組:實驗分為加S9與不加S92大類。每個類別中又將受試物分為5個劑量組，設陰性對照(自發(fā)回變)、溶劑對照以及陽性對照3個對照組，每個組別設3個平行皿進行同步實驗。陰性對照(自發(fā)回變)組只在培養(yǎng)基上加菌液，溶劑對照組為添加二甲基亞砜(DMSO)，不加S9的陽性對照物為敵克松(Dexon)，加S9的陽性對照物為2－乙酰氨基芴(2－AF)。5個劑量組分別為每皿50、100、200、400、800 μg受試物。具體操作為將受試物溶于頂層培養(yǎng)基中，放入45℃恒溫水浴保溫，再依次加入測試菌株新鮮菌液0.1 mL、S9混合液0.25 mL，混勻，迅速傾入底層培養(yǎng)基上，使之均勻分布在底層培養(yǎng)基上，平放固化。②培養(yǎng)條件和數據統(tǒng)計:接種固化后的平皿置于37℃下的恒溫箱培養(yǎng)48 h，計每皿菌落數。整個試驗重復2次。

1.3 統(tǒng)計學方法

2 結果與分析

兩次試驗結果統(tǒng)計如下，見表1，隨著受試物劑量的增加，突變菌落數隨之增加，但受試物各劑量組的回變菌落數均未超過陰性對照(自發(fā)回變)菌落數的2倍，且無劑量－反應關系，說明不論加與不加S9，受試物對鼠傷寒沙門菌TA97、TA98、TA100、TA102四株試驗菌株均未呈現(xiàn)致突變性［9］。而陽性對照組各菌株回變菌落平均數均超過其相應陰性對照組回變菌落平均數的2倍以上，證實鼠傷寒沙門氏菌的組氨酸營養(yǎng)缺陷型突變菌株對受試物的檢測有效。本實驗結果說明蕨菜乙醇提取物無致突變作用。

表1 蕨菜乙醇提取物的Ames試驗菌株的回變結果(X±S)

3 討論

Ames試驗是由Ames在1975年建立的鼠傷寒沙門氏菌回復突變試驗，是一種已被公認并廣泛采納的致突變鑒定方法［8］。蕨采乙醇提取物中的主要有效成分為黃酮類化合物，對細胞氧化系統(tǒng)有一定的保護作用［1，3－4］，提示其有一定的開發(fā)價值，但無論是保健品還是藥品開發(fā)，其安全性評價是非常重要的。本實驗研究表明蕨菜乙醇提取物在一定的劑量范圍內不具有致突變作用，有著進一步深入研究和開發(fā)的價值。

［1］ 陳乃富.蕨菜黃酮類化合物的提取及其抗氧化作用［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2003，29(11):63 －66.

［2］ 陳乃富，張莉.蕨菜黃酮類化合物的提取與分析［J］.中國林副特產，2004(6):1－4.

［3］ 陳乃富，黃新華，季洪武.蕨菜黃酮對小鼠體內丙二醛含量的影響［J］.生物學雜志，2006，23(4):30 －33.

［4］ 陳乃富，季洪武，黃新華.蕨菜黃酮對環(huán)境脅迫因子(鉛)引起的小鼠細胞氧化的影響［J］.中國中醫(yī)基礎醫(yī)學雜志，2007，13(2):120－123.

［5］ 杜文欣.現(xiàn)代保健食品研發(fā)與和生產新技術新工藝及注冊申報實用手冊:第4卷［M］.北京:中國科技文化出版社，2005:1514－1524.

［6］ 潘軍華.比色法快速測定發(fā)酵液中組氨酸［J］.無錫輕工大學學報，2002，21(3):254 －259

［7］ 王亞其，李宏霞，肖凱，等.兩種誘導方法制備大鼠肝S9在兩種遺傳毒性試驗中的比較［J］.現(xiàn)代預防醫(yī)學，2006，33(4):457－463.

［8］ 李奇慧，朱明學，張黎明，等.硫芥誘導小鼠染色體畸變和微核形成作用研究［J］.第三軍醫(yī)大學報，2004，26(19):1701－1703.

［9］ 馬茂才，黃萍，晏輝，等.納米二氧化鈦和納米鋅的Ames試驗［J］.癌變·畸變·突變，2010，22(4):302－304.