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        雙水相體系萃取分離葡萄酒下腳料中葡萄皮蛋白質(zhì)

        2013-12-08 06:43:38張喜峰馬吉福蘇風(fēng)賢張芬琴
        食品工業(yè)科技 2013年1期
        關(guān)鍵詞:雙水分配葡萄

        張喜峰,馬吉福,蘇風(fēng)賢,張芬琴

        (河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院,甘肅張掖734000)

        在葡萄酒加工過程中,每年產(chǎn)生約占葡萄加工量20%~30%的大量皮渣廢棄物,其中主要是葡萄皮、種子和果梗[1]等。葡萄皮渣含有多酚類化合物[2]、白藜蘆醇[3]、花色素[4]、萜類物質(zhì)[5]、膳食纖維[6]、蛋白質(zhì)[7]等多種功能性成分。目前我國對葡萄皮中蛋白質(zhì)的研究相對較少。王戰(zhàn)勇和蘇婷婷[7]利用傳統(tǒng)的堿液法浸提葡萄皮粗蛋白,但是在實際工業(yè)化生產(chǎn)中存在操作繁瑣、周期較長的缺點。雙水相萃取操作條件溫和、處理量大、易于連續(xù)操作、且蛋白質(zhì)能保持其天然的空間構(gòu)型,不易失活[8]。本文采用聚乙二醇和硫酸銨雙水相體系萃取葡萄酒下腳料中葡萄皮中的蛋白質(zhì)。分別考察PEG相對分子質(zhì)量、PEG質(zhì)量分數(shù)、(NH4)2SO4質(zhì)量分數(shù)、NaCl質(zhì)量分數(shù)、樣品加入量、p H、萃取時間、萃取溫度對葡萄皮蛋白質(zhì)分配系數(shù)及萃取率的影響,然后選取對萃取率影響較大的四個因素進行Box-Behnken的中心組合實驗,獲取最佳萃取條件。通過高效充分提取蛋白質(zhì),促進葡萄皮蛋白功能食品加工可持續(xù)發(fā)展,以期為葡萄皮蛋白利用開辟新的途徑,為其工業(yè)化提取葡萄皮蛋白質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

        1 材料與方法

        1.1 材料與儀器

        葡萄酒下腳料 取甘肅濱河食品工業(yè)集團,經(jīng)挑選、清洗、曬干,得到干凈的葡萄皮;PEG(600、1000、2000、4000、6000)、硫酸銨、牛血清蛋白、考馬斯亮藍G-250、磷酸、95%乙醇、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉 均為分析純。

        PL203電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;XO-SM5O超聲-微波反應(yīng)系統(tǒng) 南京先歐儀器制造有限公司;DKB-501數(shù)顯超級恒溫水浴鍋、DHG-9101.1電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 揚州市三發(fā)電子有限公司;722型分光光度計 上海光譜儀器有限公司;CR-21高速離心機 日本日立;漩渦混合器 上海精科實業(yè)有限公司。

        1.2 實驗方法

        1.2.1 粗提液的制備 葡萄皮經(jīng)干燥粉碎后,稱取30g葡萄皮粉末置于450mL磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液中,在恒溫30℃下,浸提60min。在超聲波微波反應(yīng)系統(tǒng)下對葡萄皮蛋白進行提取,將得到的懸濁液于6000r/min離心10min,傾倒上清液可得到含葡萄皮蛋白質(zhì)的粗提液,測定粗提液中蛋白質(zhì)含量。

        1.2.2 考馬斯亮藍G-250測定蛋白含量[9]5支試管中,分別精確吸取120μg/mL牛血清蛋白原液0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mL,用蒸餾水全部稀釋至1.0mL,然后分別加入5.00mL考馬斯亮藍溶液,混合均勻,于(25±1)℃的恒溫水浴中保溫10min,冷水浴中冷卻后,立即于595nm波長處比色測定。以1.0mL蒸餾水代替樣品液,加入5.00mL考馬斯亮藍溶液,其余操作同上,做空白對照。

        1.2.3 雙水相系統(tǒng)相圖制作[10]精確稱取質(zhì)量分數(shù)為50%的不同相對分子質(zhì)量的PEG于試管中,加入1g dd H2O,用滴定管緩慢滴加已配好的質(zhì)量分數(shù)為40%(NH4)2SO4溶液,并在漩渦混合器上混合,觀察溶液的澄清程度,直至試管中溶液開始出現(xiàn)渾濁為止。記錄(NH4)2SO4的加量(g)。然后加水,使其澄清,繼續(xù)向試管中滴加(NH4)2SO4溶液并不斷混勻,直至再次達到渾濁,如此反復(fù)操作。計算每次達到渾濁時,PEG和(NH4)2SO4在系統(tǒng)總量中的質(zhì)量分數(shù)(g/g),以PEG的質(zhì)量分數(shù)為縱坐標,(NH4)2SO4的質(zhì)量分數(shù)為橫坐標作圖,即得到一條雙節(jié)線。

        1.2.4 雙水相萃取方法 固定體系總質(zhì)量為10.00g,加入適量的PEG和(NH4)2SO4,充分振蕩使成相物質(zhì)溶解,同時完成了葡萄皮蛋白在雙水相系統(tǒng)中的分配過程,在一定條件下萃取。此雙水相系統(tǒng)靜置一定時間,當(dāng)兩相達到相分離,葡萄皮蛋白富集于雙水相系統(tǒng)的上相中,讀取上下相體積,求相比R;分別測定上下相蛋白質(zhì)濃度,計算葡萄皮蛋白的分配系數(shù)K及萃取率Y,如下式:

        R=上相體積(Vt)/下相體積(Vb)

        K=上相蛋白濃度(Ct)/下相蛋白濃度(Cb)

        Y(%)=RK/(1+RK)×100

        1.2.5 雙水相萃取參數(shù)選擇實驗 分別設(shè)定PEG相對分子質(zhì)量為 600、1000、2000、4000、6000,質(zhì)量分數(shù)為 10%、14%、18%、22%、26%,(NH4)2SO4質(zhì)量分數(shù)為 20%、22.5%、25%、27.5%、30%,p H5、6、7、8、9,NaCl質(zhì)量分數(shù)為0.6%、1.2%、1.8%、2.4%、3%,樣品加入量 2.4、2.9、3.4、3.9、4.4mL,溫度 25、30、35、40、45℃,萃取時間 120、160、200、240、280min,確定最佳PEG相對分子質(zhì)量。

        1.2.6 Box-Behnken的中心組合設(shè)計 在分別研究萃取單因素實驗的基礎(chǔ)上,選取對葡萄皮蛋白質(zhì)萃取率影響較大的四個因素,采用Design-Expert 8.0.5軟件對Box-Behnken的中心組合的萃取實驗結(jié)果進行分析[11]。

        2 結(jié)果與討論

        2.1 標準曲線的繪制

        用紫外可見分光光度計測595nm處吸光度,繪制蛋白總量-吸光度標準曲線,以試管中牛血清白蛋白的總量(mg)為橫坐標,相應(yīng)的吸光度值(A)為縱坐標作標準曲線,得到其線性方程為y=5.606x+0.0265(R2=0.9942)

        表1 Box-Behnken設(shè)計因素水平表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

        2.2 雙水相體系相圖

        在室溫條件下,測定不同分子量 PEG/(NH4)2SO4雙水相體系相圖,結(jié)果見圖1。考慮到萃取是在兩相條件下進行的,因此選擇在雙節(jié)線上方的質(zhì)量分數(shù)點作為單因素的參考條件。當(dāng)(NH4)2SO4質(zhì)量分數(shù)一定時,隨著PEG相對分子質(zhì)量的增大,形成雙水相體系所需PEG的濃度降低。因為PEG相對分子質(zhì)量越大,其憎水程度越強,且加大與(NH4)2SO4分相的動力,導(dǎo)致臨界分相濃度降低[12]。

        圖1 不同相對分子質(zhì)量PEG與(NH4)2 SO4的雙水相相圖Fig.1 Phase diagram of different relative molecular mass PEG and(NH4)2 SO4 in aqueous two-phase system

        2.3 雙水相萃取參數(shù)單因素實驗結(jié)果

        2.3.1 PEG相對分子質(zhì)量對葡萄皮蛋白質(zhì)分配行為的影響 成相聚合物的相對分子質(zhì)量是影響分配平衡的重要因素,降低聚合物的相對分子質(zhì)量,則蛋白質(zhì)分配于富含該聚合物的相中。從圖2可以看到,降低PEG的相對分子質(zhì)量,葡萄皮蛋白質(zhì)的分配系數(shù)和萃取率總體上呈現(xiàn)上升的趨勢,是因為PEG分子量減小時,它的疏水性顯著減弱,使葡萄皮蛋白質(zhì)在上相的表面張力減小,從而易于向上相分配[13];綜合考慮5種PEG中,PEG600的萃取效果最好,并且葡萄皮蛋白質(zhì)在PEG600-(NH4)2SO4體系中的分配系數(shù)最高,故選PEG600為雙水相系統(tǒng)成相物質(zhì)。

        2.3.2 (NH4)2SO4質(zhì)量分數(shù)對葡萄皮蛋白質(zhì)分配行為的影響 (NH4)2SO4用量不同,上下相電位差不同,而電位差的大小直接影響到分配系數(shù)和萃取率。隨著(NH4)2SO4質(zhì)量分數(shù)的增加,雙水相體系離開成相臨界點距離增大。圖3顯示,葡萄皮蛋白質(zhì)的分配系數(shù)和萃取率隨(NH4)2SO4質(zhì)量分數(shù)的增加而總體降低,是由于(NH4)2SO4的質(zhì)量分數(shù)愈高,會破壞蛋白質(zhì)表面的水化層,使蛋白質(zhì)發(fā)生鹽析,從而使其分配系數(shù)和萃取率下降;另一方面,鹽濃度過高不僅影響蛋白質(zhì)的表面疏水性,而且擾亂雙水相系統(tǒng),改變各相中成相物質(zhì)的組成[10]。固定PEG質(zhì)量分數(shù)為10%的條件下,在(NH4)2SO4質(zhì)量分數(shù)小于20%時,溶劑體系不能形成兩相。因此,確定(NH4)2SO4的質(zhì)量分數(shù)為20%。

        圖2 PEG相對分子質(zhì)量對葡萄皮蛋白質(zhì)分配行為的影響Fig.2 Effect of relative molecular mass of PEG on partitioning behaviour of grape skin proteins

        圖3 (NH4)2SO4質(zhì)量分數(shù)對葡萄皮蛋白質(zhì)分配行為的影響Fig.3 Effect of ammonium sulfate concentration on partitioning behaviour of grape skin proteins

        2.3.3 PEG600質(zhì)量分數(shù)對葡萄皮蛋白質(zhì)分配影響

        圖4表明,隨著PEG600質(zhì)量分數(shù)的增加,蛋白質(zhì)的分配系數(shù)和萃取率變化呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢,從分配理論上來講,當(dāng) PEG600用量較低時,(NH4)2SO4的鹽析作用起重要作用,隨PEG600質(zhì)量分數(shù)的增加,黏度增大,阻止相間分子轉(zhuǎn)移的能力增加,相界面張力也增加[10,14]。由圖 4 看到,當(dāng) PEG600質(zhì)量分數(shù)為22%時,葡萄皮蛋白質(zhì)的分配系數(shù)和萃取率最高,因此綜合各方面因素,最終確定PEG600質(zhì)量分數(shù)為22%最佳。

        圖4 PEG600質(zhì)量分數(shù)對葡萄皮蛋白質(zhì)分配行為的影響Fig.4 Effect of PEG 600 concentration on partitioning behaviour of grape skin proteins

        2.3.4 NaCl質(zhì)量分數(shù)對葡萄皮蛋白質(zhì)分配行為的影響 鹽的濃度對葡萄皮蛋白質(zhì)分配行為的影響主要反映在對蛋白質(zhì)疏水性的影響上。在影響生物分配的眾多因素中,用所加鹽的種類和其濃度變化來控制生物分子在雙水相中的分配是一種很有效的方法;在雙水相體系中,加入電解質(zhì)時,其陰陽離子在兩相中會有不同的分配,同時,由于電中性的約束,存在穿過相界面的電勢差,它是影響荷電大分子如蛋白質(zhì)分配的主要因素[15]。圖5顯示,隨著NaCl質(zhì)量分數(shù)的增加,葡萄皮蛋白質(zhì)的分配系數(shù)和萃取率同步變化,都先增大后減小,即在離子強度較低時,有利于葡萄皮蛋白質(zhì)分配到上相,但離子強度過高時,反而使分配系數(shù)和萃取率下降。因此選用NaCl質(zhì)量分數(shù)為1.2%進行下一步實驗。

        圖5 NaCl質(zhì)量分數(shù)對葡萄皮蛋白質(zhì)分配行為的影響Fig.5 Effect of NaCl concentration on partitioning behaviour of grape skin proteins

        2.3.5 p H對葡萄皮蛋白質(zhì)分配行為的影響 相體系的pH對被萃取物的分配有很大的影響,是由于體系的pH變化能明顯地改變兩相的電位差,而且p H的改變還導(dǎo)致蛋白質(zhì)帶電性質(zhì)的變化,即影響蛋白質(zhì)分子可離解基團的離解度,從而改變蛋白質(zhì)的表面電荷數(shù)來影響分配[13]。體系p H與葡萄皮蛋白質(zhì)的等電點pI在4附近[16],相差越大,則蛋白質(zhì)在兩相中分配愈不平均。圖6表明,葡萄皮蛋白質(zhì)的分配系數(shù)和萃取率隨著pH的增大呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢,可以看到,p H7時葡萄皮蛋白質(zhì)的分配系數(shù)和萃取率最高,因此確定最佳pH為7。

        圖6 pH對葡萄皮蛋白質(zhì)分配行為的影響Fig.6 Effect of pH on partitioning behaviour of grape skin proteins

        2.3.6 樣品加入量對葡萄皮蛋白質(zhì)分配行為的影響 圖7顯示,樣品加入量在1.9~4.4mL時,葡萄皮蛋白質(zhì)的分配系數(shù)和萃取率有先增大后減小的趨勢。當(dāng)樣品加入量為2.4mL時,葡萄皮蛋白質(zhì)的分配系數(shù)和萃取率達到最大。因此確定樣品加入量為2.4mL。

        2.3.7 萃取時間對葡萄皮蛋白分配行為的影響 圖8顯示,在80~160min范圍內(nèi),葡萄皮中蛋白質(zhì)的分配系數(shù)和萃取率先增大后減小的程度較大,在120min時達到最大值,而后隨著萃取時間的增加,基本上處于穩(wěn)定狀態(tài),考慮到后續(xù)實驗的進程,確定最佳萃取時間為2h。

        圖7 樣品加入量對葡萄皮蛋白質(zhì)分配行為的影響Fig.7 Effect of sample volume added on partitioning behaviour of grape skin proteins

        圖8 時間對葡萄皮蛋白質(zhì)分配行為的影響Fig.8 Effect of time on partitioning behaviour of grape skin proteins

        2.3.8 萃取溫度對葡萄皮蛋白質(zhì)分配行為的影響溫度的變化可以影響物質(zhì)的成相濃度,進而影響其分配。但一般說來,1~2℃的溫度改變不會影響目標產(chǎn)物的萃取分離。因此基于經(jīng)濟及操作的角度考慮,大規(guī)模的雙水相操作一般在室溫下進行[17]。圖9顯示,葡萄皮蛋白質(zhì)的分配系數(shù)和萃取率對溫度的變化較為敏感,溫度通過影響相圖進而影響分配系數(shù),因此在實驗中對某些敏感的相體系仍要注意溫度影響。在臨界點附近,溫度對相圖的影響最顯著,對分配系數(shù)的影響最強。當(dāng)遠離臨界點時,溫度對相圖的影響較小,分配系數(shù)對溫度的變化也不敏感,這是因為遠離臨界點時,成相聚合物的濃度增大,對蛋白質(zhì)的穩(wěn)定作用增強[13]。實驗結(jié)果表明,葡萄皮中蛋白質(zhì)的分配系數(shù)和萃取率呈現(xiàn)不規(guī)則的變化,綜合考慮,確定35℃為最佳溫度。

        圖9 溫度對葡萄皮蛋白質(zhì)分配行為的影響Fig.9 Effect of temperature on partitioning behaviour of grape skin proteins

        2.4 雙水相萃取工藝優(yōu)化

        2.4.1 響應(yīng)面結(jié)果分析 根據(jù)以上單因素的實驗結(jié)果,采用響應(yīng)面方法進一步優(yōu)化實驗條件。根據(jù)Box-Behnken的中心組合設(shè)計原理,以萃取率為響應(yīng)值,在PEG600-(NH4)2SO4體系基礎(chǔ)上,對pH(A)、NaCl質(zhì)量分數(shù)(B)、樣品加入量(C)和溫度(D)設(shè)計了4因素3水平的29組實驗,其中5組中心點重復(fù)實驗。實驗結(jié)果見表2。

        表2 Box-Behnken設(shè)計方案與結(jié)果Table 2 Arrangement and results of Box-Behnken design

        2.4.2 Box-Benhnken Design實驗數(shù)據(jù)分析 以葡萄皮蛋白質(zhì)萃取率Y(%)為響應(yīng)值,根據(jù)表2的實驗結(jié)果,用Design-Expert 8.0.5.0軟件進行多元回歸分析,方差分析及F檢驗結(jié)果列于表3。經(jīng)回歸擬合后,實驗因子對響應(yīng)值的影響可用以下回歸方程表示:

        Y=31.556+1.198333A+0.703333B+0.720833C+0.425833D+0.485AB-0.2825AC+0.1675AD-0.2125BC+0.3375BD-2.0075CD-6.29092A2-6.53842B2-6.29467C2-5.80217D2

        由表3可以看到,本模型擬合程度明顯,其F=12.84,p<0.0001,說明僅有不到0.01%的概率模型不顯著;對其失擬檢驗的F值為2.75,說明存在17.08%的概率失擬,失擬項在α=0.05水平上不顯著(p=0.1708>0.05),模型決定系數(shù)為92.78%,說明該模型具有較好的可信度,自變量與響應(yīng)值之間的線性關(guān)系顯著,可用于實驗的理論預(yù)測[18]。在表中p<0.05,對應(yīng)項為模型影響顯著項,因此該模型中顯著項為 A2、B2、C2、D2。在所選取的各因素水平范圍內(nèi),按照對結(jié)果的影響排序:p H(A)>樣品加入量(C)>NaCl質(zhì)量分數(shù)(B)>溫度(D)。

        表3 對擬合二次多元模型的方差分析結(jié)果Table 3 Variance analysis results for the fitted quadratic polynomial model

        2.4.3 顯著因素水平的優(yōu)化 利用Design-Expert 8.0.5.0軟件根據(jù)回歸方程進行響應(yīng)面分析,繪制響應(yīng)面分析曲面圖,結(jié)果如圖10所示,每個響應(yīng)面分析圖分別代表著兩個獨立變量之間的相互作用,此時第3、4個變量保持在最佳水平。利用 Design-Expert 8.0.5軟件對蛋白質(zhì)萃取率的二次多項式數(shù)學(xué)模型進行求導(dǎo),可獲得該模型極值點,即pH7.1、NaCl質(zhì)量分數(shù)為1.2%、樣品加入量為2.41mL、溫度為35.2℃。此時葡萄皮蛋白質(zhì)的萃取率可達31.66%。

        2.4.4 模型驗證實驗 以響應(yīng)面實驗優(yōu)化得到雙水相體系組成條件進行蛋白質(zhì)萃取實驗,做3組平行實驗所得結(jié)果為31.08%,與預(yù)測值相差0.58%,由此可見,采用響應(yīng)面分析法對葡萄皮蛋白質(zhì)的最佳萃取條件的優(yōu)化是行之有效的。

        3 結(jié)論

        通過單因素實驗和響應(yīng)面分析法,確定葡萄皮蛋白質(zhì)所需的最佳萃取條件為:PEG600質(zhì)量分數(shù)為22%,(NH4)2SO4質(zhì)量分數(shù)為20%,pH為7.1,NaCl質(zhì)量分數(shù)為1.2%,樣品加入量為2.41mL,溫度為35.2℃,萃取時間2h,萃取率為31.08%。因此,利用響應(yīng)面分析方法對葡萄皮蛋白質(zhì)的萃取條件進行優(yōu)化,可以獲得最優(yōu)的工藝參數(shù),能有效的減少工藝操作的盲目性,從而為進一步的實驗研究奠定基礎(chǔ)。

        圖10 各因素交互作用的響應(yīng)面和等高線圖Fig.10 Response surface plots for the pairwise interactive effects

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        女報(2020年10期)2020-11-23 01:42:42
        應(yīng)答器THR和TFFR分配及SIL等級探討
        遺產(chǎn)的分配
        一種分配十分不均的財富
        績效考核分配的實踐與思考
        超聲輔助雙水相提取大黃中蒽醌類成分
        小青蛙報(2016年2期)2016-10-15 05:05:56
        醇與離子液體二元雙水相體系萃取四環(huán)素
        溫度誘導(dǎo)雙水相提取分離白藜蘆醇苷的研究
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