張喜峰，馬吉福，蘇風(fēng)賢，張芬琴

(河西學(xué)院農(nóng)業(yè)與生物技術(shù)學(xué)院，甘肅張掖734000)

在葡萄酒加工過程中，每年產(chǎn)生約占葡萄加工量20%～30%的大量皮渣廢棄物，其中主要是葡萄皮、種子和果梗［1］等。葡萄皮渣含有多酚類化合物［2］、白藜蘆醇［3］、花色素［4］、萜類物質(zhì)［5］、膳食纖維［6］、蛋白質(zhì)［7］等多種功能性成分。目前我國對葡萄皮中蛋白質(zhì)的研究相對較少。王戰(zhàn)勇和蘇婷婷［7］利用傳統(tǒng)的堿液法浸提葡萄皮粗蛋白，但是在實(shí)際工業(yè)化生產(chǎn)中存在操作繁瑣、周期較長的缺點(diǎn)。雙水相萃取操作條件溫和、處理量大、易于連續(xù)操作、且蛋白質(zhì)能保持其天然的空間構(gòu)型，不易失活［8］。本文采用聚乙二醇和硫酸銨雙水相體系萃取葡萄酒下腳料中葡萄皮中的蛋白質(zhì)。分別考察PEG相對分子質(zhì)量、PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)、(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)、NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)、樣品加入量、p H、萃取時間、萃取溫度對葡萄皮蛋白質(zhì)分配系數(shù)及萃取率的影響，然后選取對萃取率影響較大的四個因素進(jìn)行Box-Behnken的中心組合實(shí)驗(yàn)，獲取最佳萃取條件。通過高效充分提取蛋白質(zhì)，促進(jìn)葡萄皮蛋白功能食品加工可持續(xù)發(fā)展，以期為葡萄皮蛋白利用開辟新的途徑，為其工業(yè)化提取葡萄皮蛋白質(zhì)奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

葡萄酒下腳料 取甘肅濱河食品工業(yè)集團(tuán)，經(jīng)挑選、清洗、曬干，得到干凈的葡萄皮;PEG(600、1000、2000、4000、6000)、硫酸銨、牛血清蛋白、考馬斯亮藍(lán)G-250、磷酸、95%乙醇、磷酸氫二鈉、磷酸二氫鈉、氯化鈉 均為分析純。

PL203電子天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;XO-SM5O超聲-微波反應(yīng)系統(tǒng) 南京先歐儀器制造有限公司;DKB-501數(shù)顯超級恒溫水浴鍋、DHG-9101.1電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 揚(yáng)州市三發(fā)電子有限公司;722型分光光度計(jì) 上海光譜儀器有限公司;CR-21高速離心機(jī) 日本日立;漩渦混合器 上海精科實(shí)業(yè)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 粗提液的制備 葡萄皮經(jīng)干燥粉碎后，稱取30g葡萄皮粉末置于450mL磷酸二氫鈉-磷酸氫二鈉緩沖液中，在恒溫30℃下，浸提60min。在超聲波微波反應(yīng)系統(tǒng)下對葡萄皮蛋白進(jìn)行提取，將得到的懸濁液于6000r/min離心10min，傾倒上清液可得到含葡萄皮蛋白質(zhì)的粗提液，測定粗提液中蛋白質(zhì)含量。

1.2.2 考馬斯亮藍(lán)G-250測定蛋白含量［9］5支試管中，分別精確吸取120μg/mL牛血清蛋白原液0.20、0.40、0.60、0.80、1.00mL，用蒸餾水全部稀釋至1.0mL，然后分別加入5.00mL考馬斯亮藍(lán)溶液，混合均勻，于(25±1)℃的恒溫水浴中保溫10min，冷水浴中冷卻后，立即于595nm波長處比色測定。以1.0mL蒸餾水代替樣品液，加入5.00mL考馬斯亮藍(lán)溶液，其余操作同上，做空白對照。

1.2.3 雙水相系統(tǒng)相圖制作［10］精確稱取質(zhì)量分?jǐn)?shù)為50%的不同相對分子質(zhì)量的PEG于試管中，加入1g dd H2O，用滴定管緩慢滴加已配好的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為40%(NH4)2SO4溶液，并在漩渦混合器上混合，觀察溶液的澄清程度，直至試管中溶液開始出現(xiàn)渾濁為止。記錄(NH4)2SO4的加量(g)。然后加水，使其澄清，繼續(xù)向試管中滴加(NH4)2SO4溶液并不斷混勻，直至再次達(dá)到渾濁，如此反復(fù)操作。計(jì)算每次達(dá)到渾濁時，PEG和(NH4)2SO4在系統(tǒng)總量中的質(zhì)量分?jǐn)?shù)(g/g)，以PEG的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為縱坐標(biāo)，(NH4)2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為橫坐標(biāo)作圖，即得到一條雙節(jié)線。

1.2.4 雙水相萃取方法 固定體系總質(zhì)量為10.00g，加入適量的PEG和(NH4)2SO4，充分振蕩使成相物質(zhì)溶解，同時完成了葡萄皮蛋白在雙水相系統(tǒng)中的分配過程，在一定條件下萃取。此雙水相系統(tǒng)靜置一定時間，當(dāng)兩相達(dá)到相分離，葡萄皮蛋白富集于雙水相系統(tǒng)的上相中，讀取上下相體積，求相比R;分別測定上下相蛋白質(zhì)濃度，計(jì)算葡萄皮蛋白的分配系數(shù)K及萃取率Y，如下式:

R=上相體積(Vt)/下相體積(Vb)

K=上相蛋白濃度(Ct)/下相蛋白濃度(Cb)

Y(%)=RK/(1+RK)×100

1.2.5 雙水相萃取參數(shù)選擇實(shí)驗(yàn) 分別設(shè)定PEG相對分子質(zhì)量為 600、1000、2000、4000、6000，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 10%、14%、18%、22%、26%，(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為 20%、22.5%、25%、27.5%、30%，p H5、6、7、8、9，NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為0.6%、1.2%、1.8%、2.4%、3%，樣品加入量 2.4、2.9、3.4、3.9、4.4mL，溫度 25、30、35、40、45℃，萃取時間 120、160、200、240、280min，確定最佳PEG相對分子質(zhì)量。

1.2.6 Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì) 在分別研究萃取單因素實(shí)驗(yàn)的基礎(chǔ)上，選取對葡萄皮蛋白質(zhì)萃取率影響較大的四個因素，采用Design-Expert 8.0.5軟件對Box-Behnken的中心組合的萃取實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析［11］。

2 結(jié)果與討論

2.1 標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制

用紫外可見分光光度計(jì)測595nm處吸光度，繪制蛋白總量-吸光度標(biāo)準(zhǔn)曲線，以試管中牛血清白蛋白的總量(mg)為橫坐標(biāo)，相應(yīng)的吸光度值(A)為縱坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到其線性方程為y=5.606x+0.0265(R2=0.9942)

表1 Box-Behnken設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Factors and levels of Box-Behnken design

2.2 雙水相體系相圖

在室溫條件下，測定不同分子量 PEG/(NH4)2SO4雙水相體系相圖，結(jié)果見圖1。考慮到萃取是在兩相條件下進(jìn)行的，因此選擇在雙節(jié)線上方的質(zhì)量分?jǐn)?shù)點(diǎn)作為單因素的參考條件。當(dāng)(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)一定時，隨著PEG相對分子質(zhì)量的增大，形成雙水相體系所需PEG的濃度降低。因?yàn)镻EG相對分子質(zhì)量越大，其憎水程度越強(qiáng)，且加大與(NH4)2SO4分相的動力，導(dǎo)致臨界分相濃度降低［12］。

圖1 不同相對分子質(zhì)量PEG與(NH4)2 SO4的雙水相相圖Fig.1 Phase diagram of different relative molecular mass PEG and(NH4)2 SO4 in aqueous two-phase system

2.3 雙水相萃取參數(shù)單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果

2.3.1 PEG相對分子質(zhì)量對葡萄皮蛋白質(zhì)分配行為的影響 成相聚合物的相對分子質(zhì)量是影響分配平衡的重要因素，降低聚合物的相對分子質(zhì)量，則蛋白質(zhì)分配于富含該聚合物的相中。從圖2可以看到，降低PEG的相對分子質(zhì)量，葡萄皮蛋白質(zhì)的分配系數(shù)和萃取率總體上呈現(xiàn)上升的趨勢，是因?yàn)镻EG分子量減小時，它的疏水性顯著減弱，使葡萄皮蛋白質(zhì)在上相的表面張力減小，從而易于向上相分配［13］;綜合考慮5種PEG中，PEG600的萃取效果最好，并且葡萄皮蛋白質(zhì)在PEG600-(NH4)2SO4體系中的分配系數(shù)最高，故選PEG600為雙水相系統(tǒng)成相物質(zhì)。

2.3.2 (NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對葡萄皮蛋白質(zhì)分配行為的影響 (NH4)2SO4用量不同，上下相電位差不同，而電位差的大小直接影響到分配系數(shù)和萃取率。隨著(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，雙水相體系離開成相臨界點(diǎn)距離增大。圖3顯示，葡萄皮蛋白質(zhì)的分配系數(shù)和萃取率隨(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加而總體降低，是由于(NH4)2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)愈高，會破壞蛋白質(zhì)表面的水化層，使蛋白質(zhì)發(fā)生鹽析，從而使其分配系數(shù)和萃取率下降;另一方面，鹽濃度過高不僅影響蛋白質(zhì)的表面疏水性，而且擾亂雙水相系統(tǒng)，改變各相中成相物質(zhì)的組成［10］。固定PEG質(zhì)量分?jǐn)?shù)為10%的條件下，在(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)小于20%時，溶劑體系不能形成兩相。因此，確定(NH4)2SO4的質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%。

圖2 PEG相對分子質(zhì)量對葡萄皮蛋白質(zhì)分配行為的影響Fig.2 Effect of relative molecular mass of PEG on partitioning behaviour of grape skin proteins

圖3 (NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)對葡萄皮蛋白質(zhì)分配行為的影響Fig.3 Effect of ammonium sulfate concentration on partitioning behaviour of grape skin proteins

2.3.3 PEG600質(zhì)量分?jǐn)?shù)對葡萄皮蛋白質(zhì)分配影響

圖4表明，隨著PEG600質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，蛋白質(zhì)的分配系數(shù)和萃取率變化呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢，從分配理論上來講，當(dāng) PEG600用量較低時，(NH4)2SO4的鹽析作用起重要作用，隨PEG600質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，黏度增大，阻止相間分子轉(zhuǎn)移的能力增加，相界面張力也增加［10，14］。由圖 4 看到，當(dāng) PEG600質(zhì)量分?jǐn)?shù)為22%時，葡萄皮蛋白質(zhì)的分配系數(shù)和萃取率最高，因此綜合各方面因素，最終確定PEG600質(zhì)量分?jǐn)?shù)為22%最佳。

圖4 PEG600質(zhì)量分?jǐn)?shù)對葡萄皮蛋白質(zhì)分配行為的影響Fig.4 Effect of PEG 600 concentration on partitioning behaviour of grape skin proteins

2.3.4 NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對葡萄皮蛋白質(zhì)分配行為的影響 鹽的濃度對葡萄皮蛋白質(zhì)分配行為的影響主要反映在對蛋白質(zhì)疏水性的影響上。在影響生物分配的眾多因素中，用所加鹽的種類和其濃度變化來控制生物分子在雙水相中的分配是一種很有效的方法;在雙水相體系中，加入電解質(zhì)時，其陰陽離子在兩相中會有不同的分配，同時，由于電中性的約束，存在穿過相界面的電勢差，它是影響荷電大分子如蛋白質(zhì)分配的主要因素［15］。圖5顯示，隨著NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)的增加，葡萄皮蛋白質(zhì)的分配系數(shù)和萃取率同步變化，都先增大后減小，即在離子強(qiáng)度較低時，有利于葡萄皮蛋白質(zhì)分配到上相，但離子強(qiáng)度過高時，反而使分配系數(shù)和萃取率下降。因此選用NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.2%進(jìn)行下一步實(shí)驗(yàn)。

圖5 NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)對葡萄皮蛋白質(zhì)分配行為的影響Fig.5 Effect of NaCl concentration on partitioning behaviour of grape skin proteins

2.3.5 p H對葡萄皮蛋白質(zhì)分配行為的影響 相體系的pH對被萃取物的分配有很大的影響，是由于體系的pH變化能明顯地改變兩相的電位差，而且p H的改變還導(dǎo)致蛋白質(zhì)帶電性質(zhì)的變化，即影響蛋白質(zhì)分子可離解基團(tuán)的離解度，從而改變蛋白質(zhì)的表面電荷數(shù)來影響分配［13］。體系p H與葡萄皮蛋白質(zhì)的等電點(diǎn)pI在4附近［16］，相差越大，則蛋白質(zhì)在兩相中分配愈不平均。圖6表明，葡萄皮蛋白質(zhì)的分配系數(shù)和萃取率隨著pH的增大呈現(xiàn)先增加后減小的趨勢，可以看到，p H7時葡萄皮蛋白質(zhì)的分配系數(shù)和萃取率最高，因此確定最佳pH為7。

圖6 pH對葡萄皮蛋白質(zhì)分配行為的影響Fig.6 Effect of pH on partitioning behaviour of grape skin proteins

2.3.6 樣品加入量對葡萄皮蛋白質(zhì)分配行為的影響 圖7顯示，樣品加入量在1.9～4.4mL時，葡萄皮蛋白質(zhì)的分配系數(shù)和萃取率有先增大后減小的趨勢。當(dāng)樣品加入量為2.4mL時，葡萄皮蛋白質(zhì)的分配系數(shù)和萃取率達(dá)到最大。因此確定樣品加入量為2.4mL。

2.3.7 萃取時間對葡萄皮蛋白分配行為的影響 圖8顯示，在80～160min范圍內(nèi)，葡萄皮中蛋白質(zhì)的分配系數(shù)和萃取率先增大后減小的程度較大，在120min時達(dá)到最大值，而后隨著萃取時間的增加，基本上處于穩(wěn)定狀態(tài)，考慮到后續(xù)實(shí)驗(yàn)的進(jìn)程，確定最佳萃取時間為2h。

圖7 樣品加入量對葡萄皮蛋白質(zhì)分配行為的影響Fig.7 Effect of sample volume added on partitioning behaviour of grape skin proteins

圖8 時間對葡萄皮蛋白質(zhì)分配行為的影響Fig.8 Effect of time on partitioning behaviour of grape skin proteins

2.3.8 萃取溫度對葡萄皮蛋白質(zhì)分配行為的影響溫度的變化可以影響物質(zhì)的成相濃度，進(jìn)而影響其分配。但一般說來，1～2℃的溫度改變不會影響目標(biāo)產(chǎn)物的萃取分離。因此基于經(jīng)濟(jì)及操作的角度考慮，大規(guī)模的雙水相操作一般在室溫下進(jìn)行［17］。圖9顯示，葡萄皮蛋白質(zhì)的分配系數(shù)和萃取率對溫度的變化較為敏感，溫度通過影響相圖進(jìn)而影響分配系數(shù)，因此在實(shí)驗(yàn)中對某些敏感的相體系仍要注意溫度影響。在臨界點(diǎn)附近，溫度對相圖的影響最顯著，對分配系數(shù)的影響最強(qiáng)。當(dāng)遠(yuǎn)離臨界點(diǎn)時，溫度對相圖的影響較小，分配系數(shù)對溫度的變化也不敏感，這是因?yàn)檫h(yuǎn)離臨界點(diǎn)時，成相聚合物的濃度增大，對蛋白質(zhì)的穩(wěn)定作用增強(qiáng)［13］。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，葡萄皮中蛋白質(zhì)的分配系數(shù)和萃取率呈現(xiàn)不規(guī)則的變化，綜合考慮，確定35℃為最佳溫度。

圖9 溫度對葡萄皮蛋白質(zhì)分配行為的影響Fig.9 Effect of temperature on partitioning behaviour of grape skin proteins

2.4 雙水相萃取工藝優(yōu)化

2.4.1 響應(yīng)面結(jié)果分析 根據(jù)以上單因素的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，采用響應(yīng)面方法進(jìn)一步優(yōu)化實(shí)驗(yàn)條件。根據(jù)Box-Behnken的中心組合設(shè)計(jì)原理，以萃取率為響應(yīng)值，在PEG600-(NH4)2SO4體系基礎(chǔ)上，對pH(A)、NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)(B)、樣品加入量(C)和溫度(D)設(shè)計(jì)了4因素3水平的29組實(shí)驗(yàn)，其中5組中心點(diǎn)重復(fù)實(shí)驗(yàn)。實(shí)驗(yàn)結(jié)果見表2。

表2 Box-Behnken設(shè)計(jì)方案與結(jié)果Table 2 Arrangement and results of Box-Behnken design

2.4.2 Box-Benhnken Design實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)分析 以葡萄皮蛋白質(zhì)萃取率Y(%)為響應(yīng)值，根據(jù)表2的實(shí)驗(yàn)結(jié)果，用Design-Expert 8.0.5.0軟件進(jìn)行多元回歸分析，方差分析及F檢驗(yàn)結(jié)果列于表3。經(jīng)回歸擬合后，實(shí)驗(yàn)因子對響應(yīng)值的影響可用以下回歸方程表示:

Y=31.556+1.198333A+0.703333B+0.720833C+0.425833D+0.485AB-0.2825AC+0.1675AD-0.2125BC+0.3375BD-2.0075CD-6.29092A2-6.53842B2-6.29467C2-5.80217D2

由表3可以看到，本模型擬合程度明顯，其F=12.84，p＜0.0001，說明僅有不到0.01%的概率模型不顯著;對其失擬檢驗(yàn)的F值為2.75，說明存在17.08%的概率失擬，失擬項(xiàng)在α=0.05水平上不顯著(p=0.1708＞0.05)，模型決定系數(shù)為92.78%，說明該模型具有較好的可信度，自變量與響應(yīng)值之間的線性關(guān)系顯著，可用于實(shí)驗(yàn)的理論預(yù)測［18］。在表中p＜0.05，對應(yīng)項(xiàng)為模型影響顯著項(xiàng)，因此該模型中顯著項(xiàng)為 A2、B2、C2、D2。在所選取的各因素水平范圍內(nèi)，按照對結(jié)果的影響排序:p H(A)＞樣品加入量(C)＞NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)(B)＞溫度(D)。

表3 對擬合二次多元模型的方差分析結(jié)果Table 3 Variance analysis results for the fitted quadratic polynomial model

2.4.3 顯著因素水平的優(yōu)化 利用Design-Expert 8.0.5.0軟件根據(jù)回歸方程進(jìn)行響應(yīng)面分析，繪制響應(yīng)面分析曲面圖，結(jié)果如圖10所示，每個響應(yīng)面分析圖分別代表著兩個獨(dú)立變量之間的相互作用，此時第3、4個變量保持在最佳水平。利用 Design-Expert 8.0.5軟件對蛋白質(zhì)萃取率的二次多項(xiàng)式數(shù)學(xué)模型進(jìn)行求導(dǎo)，可獲得該模型極值點(diǎn)，即pH7.1、NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.2%、樣品加入量為2.41mL、溫度為35.2℃。此時葡萄皮蛋白質(zhì)的萃取率可達(dá)31.66%。

2.4.4 模型驗(yàn)證實(shí)驗(yàn) 以響應(yīng)面實(shí)驗(yàn)優(yōu)化得到雙水相體系組成條件進(jìn)行蛋白質(zhì)萃取實(shí)驗(yàn)，做3組平行實(shí)驗(yàn)所得結(jié)果為31.08%，與預(yù)測值相差0.58%，由此可見，采用響應(yīng)面分析法對葡萄皮蛋白質(zhì)的最佳萃取條件的優(yōu)化是行之有效的。

3 結(jié)論

通過單因素實(shí)驗(yàn)和響應(yīng)面分析法，確定葡萄皮蛋白質(zhì)所需的最佳萃取條件為:PEG600質(zhì)量分?jǐn)?shù)為22%，(NH4)2SO4質(zhì)量分?jǐn)?shù)為20%，pH為7.1，NaCl質(zhì)量分?jǐn)?shù)為1.2%，樣品加入量為2.41mL，溫度為35.2℃，萃取時間2h，萃取率為31.08%。因此，利用響應(yīng)面分析方法對葡萄皮蛋白質(zhì)的萃取條件進(jìn)行優(yōu)化，可以獲得最優(yōu)的工藝參數(shù)，能有效的減少工藝操作的盲目性，從而為進(jìn)一步的實(shí)驗(yàn)研究奠定基礎(chǔ)。

圖10 各因素交互作用的響應(yīng)面和等高線圖Fig.10 Response surface plots for the pairwise interactive effects

［1］彭麗霞，黃彥芳，劉翠平，等.釀酒葡萄皮渣的綜合利用［J］.釀酒科技，2010(10):93-96.

［2］范濟(jì)民，趙志換，穆瑞娜.葡萄皮中多酚的提取及其抗氧化活性研究［J］.化學(xué)與生物工程，2010，27(10):59-61.

［3］向陽，張彤.高效液相色譜法測定葡萄皮和葡萄籽中白藜蘆醇的含量［J］.衛(wèi)生研究，2005，32(5):490-494.

［4］楊夫臣，吳江.葡萄果皮花色素的提取及其理化性質(zhì)［J］.果樹報，2007，24(3):287-292.

［5］田麗婷，馬龍.超臨界二氧化碳萃取葡萄皮渣中三萜類總組分［J］.中國現(xiàn)代應(yīng)用藥學(xué)雜志，2004，21(1):6-8.

［6］孫艷，房玉林，張昂，等.葡萄皮渣中可溶性膳食纖維提取工藝研究［J］.西北農(nóng)林科技大學(xué)學(xué)報，2010，38(10):147-151.

［7］王戰(zhàn)勇，蘇婷婷.葡萄皮中粗蛋白提取條件的研究［J］.氨基酸和生物資源，2004，26(2):6-7.

［8］馬春宏，朱紅，王良，等.雙水相萃取技術(shù)的應(yīng)用研究進(jìn)展［J］.光譜實(shí)驗(yàn)室，2010，27(5):1906-1913.

［9］劉葉青.生物分離工程實(shí)驗(yàn)［M］.北京:高等教育出版，2007:81-82.

［10］周紅航，王維香.聚乙二醇/硫酸銨雙水相體系萃取豬胰蛋白酶［J］.化工進(jìn)展，2009，28(2):305-308.

［11］Jiang L F.Optimization of fermentation conditions for pullulan production by Aureobasidium pullulans using response surface methodology［J］.Carbohydrate Polymers，2010，79:414-417.

［12］袁晶，宋達(dá)峰，胡煒力，等.響應(yīng)面法優(yōu)化植物乳桿菌素的雙水相萃取條件［J］.中國食品學(xué)報，2011，11(3):90-96.

［13］鄭楠，劉杰.雙水相萃取技術(shù)分離純化蛋白質(zhì)的研究［J］.化學(xué)與生物工程，2006，23(10):7-9.

［14］曹對喜，杜征，韓玉婷，等.雙水相萃取法提取木瓜蛋白酶的研究［J］.農(nóng)產(chǎn)品加工，2010(10):66-69.

［15］張?zhí)m威，陳一，韓雪，等.雙水相萃取法從風(fēng)干香腸中分離提取蛋白酶［J］.分析化學(xué)，2008，36(7):901-904.

［16］張喜峰，李彩霞，崔瑋，等.反膠團(tuán)萃取分離葡萄酒下腳料中葡萄皮蛋白質(zhì)［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2012，38(2):212-218.

［17］趙曉紅.雙水相萃取/浮選分離-富集環(huán)境中持久性污染物的研究［D］.鎮(zhèn)江:江蘇大學(xué)，2011.

［18］孟憲軍，王冠群，宋德群，等.響應(yīng)面法優(yōu)化藍(lán)莓花色苷提取工藝的研究［J］.食品工業(yè)科技，2010，31(7):226-229.