張圣燕，張 成

(濱州學院化學與化工系，山東濱州256603)

冬棗為鼠李科棗屬植物，具有很好的醫(yī)用價值，成熟棗果中的營養(yǎng)成分已被研究，并被提取出來［1-2］。而冬棗葉卻被大量廢棄，研究表明，棗葉中含有甜味抑制劑、黃酮類化合物和生物堿等有效成分［3］。其中黃酮類化合物具有防癌抗癌、抗腫瘤、抗心腦血管疾病、抗骨質(zhì)疏松、清除自由基和抗氧化等生理活性［4］，在醫(yī)藥、食品領域有著重要的應用。冬棗葉中總黃酮的提取可為冬棗葉的開發(fā)利用提供新的方向。目前，總黃酮的提取方法主要有溶劑浸提法［5］、微波提取法［6］、超聲波提取法［7］、超臨界 CO2萃取法［8］和酶提取法［9］等，而對冬棗葉中總黃酮提取工藝的研究還較少。本文利用纖維素酶酶解細胞壁，采用纖維素酶提取冬棗中的總黃酮，研究提取條件對總黃酮提取率的影響，優(yōu)化提取工藝，為冬棗葉的綜合利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

冬棗葉 采摘自濱州沾化冬棗園;纖維素酶(30units/mg) 日本;蘆丁標準品(純度≥98%)

購于北京世紀奧科生物科技有限公司;無水乙醇、硝酸鋁、亞硝酸鈉、氫氧化鈉、石油醚 均為分析純。

Agilent8451型紫外分光光度計 美國Agilent;B-220型恒溫水浴鍋 北京泰克儀器有限公司;T203型電子天平 北京賽多利斯儀器系統(tǒng)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 冬棗葉中總黃酮的提取工藝 冬棗葉洗凈，烘干(50℃)至恒重，粉碎，過 40目篩，石油醚(60～90℃)浸泡30min后，超聲脫脂20min，過濾。重復1次。殘渣揮干溶劑后，密封備用。

準確稱取預處理好的冬棗葉粉末1.0g，加入70%的乙醇溶液和纖維素酶，進行酶提取，提取后過濾，得總黃酮的粗提取液。

1.2.2 標準曲線的繪制 準確稱取蘆丁標準品10.92mg，溶解后，轉(zhuǎn)移至50mL容量瓶中，70%的乙醇定容，制成濃度為0.2184mg/mL的蘆丁標液。

準確量取蘆丁標液 0.0、0.5、1.0、2.0、3.0、4.0mL于6支10mL容量瓶中，分別加入5%的亞硝酸鈉溶液0.3mL，搖勻，放置6min，然后加入10%的硝酸鋁溶液0.3mL，搖勻，放置6min，再加入4%的氫氧化鈉溶液4.0mL，70% 的乙醇定容，搖勻，靜置 15min［5］。以試劑空白為參比，在510nm處測吸光度，做蘆丁濃度-吸光度標準曲線，得回歸方程為:A=13.02913×C+0.033，其線性相關系數(shù)為R2=0.9994。

1.2.3 總黃酮含量的測定 將總黃酮的粗提取液轉(zhuǎn)移到100mL容量瓶中，70%的乙醇定容，搖勻后，待用。準確吸取3.0mL定容液于10mL容量瓶中，加入顯色劑(5%亞硝酸鈉溶液0.3mL，10%硝酸鋁溶液0.3mL，4%氫氧化鈉溶液4.0mL)后，定容，搖勻，靜置15min，以試劑空白為參比，在510nm波長下，測定吸光度，根據(jù)標準曲線方程計算濃度，得出提取率。

總黃酮的提取率(%)

式中:C-總黃酮濃度，mg/mL。

1.2.4 單因素實驗

1.2.4.1 提取溫度對總黃酮提取率的影響 料液比為1∶40(g/mL)，酶用量為3mg/g，提取溫度分別為35、45、55、65、75℃，提取時間為 90min 的條件下，提取冬棗葉中的總黃酮，測定并計算提取率。

1.2.4.2 提取時間對總黃酮提取率的影響 料液比為1∶40(g/mL)，酶用量為3mg/g，提取溫度為55℃，提取時間分別為30、60、90、120、150min 的條件下，提取冬棗中的總黃酮，測定并計算提取率。

1.2.4.3 酶用量對總黃酮提取率的影響 料液比為1∶40(g/mL)，酶用量分別為 1、2、3、4、5mg/g，提取溫度為55℃，提取時間為90min的條件下，提取冬棗中的總黃酮，測定并計算提取率。

1.2.4.4 料液比對總黃酮提取率的影響 料液比(g/mL)為1∶20、1∶30、1∶40、1∶50、1∶60，酶用量為4mg/g，提取溫度為55℃，提取時間為90min的條件下，提取冬棗中的總黃酮，測定并計算提取率。

1.2.5 正交實驗 在上述單因素實驗的基礎上，以提取溫度、提取時間、酶用量、料液比為因素設計正交實驗，以確定冬棗葉中總黃酮的最佳提取工藝條件，因素水平見表1。

表1 L9(34)正交因素水平表Table 1 Factors and levels of orthogonal test

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗

2.1.1 提取溫度對總黃酮提取率的影響 由圖1可以看出，總黃酮的提取率最初隨著提取溫度的升高而增加，當提取溫度達到55℃左右時，總黃酮的提取率達到最高，繼續(xù)升高溫度，總黃酮的提取率開始降低。這是因為，溫度較低時，纖維素酶的活性較低，提取效果較差，隨溫度的升高，酶的活性逐漸增強，提取率增加，但當溫度超過55℃后，纖維素酶開始變性失活，導致總黃酮的提取率開始降低。

圖1 提取溫度對總黃酮提取率的影響曲線Fig.1 Influence of extraction temperature on total flavones extraction rate

2.1.2 提取時間對總黃酮提取率的影響 由圖2可見，隨著提取時間的增長，總黃酮的提取率逐漸增加，當提取時間達到90min后，總黃酮的提取率增加不明顯。這說明在90min時，提取效果已基本達到最佳，再延長提取時間對黃酮的提取率無顯著影響。

圖2 提取時間對總黃酮提取率的影響曲線Fig.2 Influence of extraction time on total flavones extraction rate

2.1.3 酶用量對總黃酮提取率的影響 由圖3可見，總黃酮的提取率隨著酶用量的增加而增加，當纖維素酶用量達到4mg/g左右時，總黃酮提取率增加變緩慢。這表明，當酶用量達到4mg/g時，冬棗葉黃酮的提取效果已趨于最佳，再增加酶用量，對黃酮的提取率影響不大，且造成材料浪費。

圖3 酶用量對總黃酮提取率的影響曲線Fig.3 Influence of enzyme amount on total flavones extraction rate

2.1.4 料液比對總黃酮提取率的影響 由圖4可見，總黃酮提取率隨著料液比中溶劑量的增加先增加后降低，當料液比為1∶40時，提取率達到最大。這是因為，溶劑量的增大，使得總黃酮的溶出量增加，引起提取率增加;但溶劑量的增加也引起一些醇溶性雜質(zhì)、親脂性強的成分溶出量增多，這些成分與黃酮類物質(zhì)競爭乙醇-水分子，可導致黃酮的溶出量減少，從而降低總黃酮的提取率［10］。

圖4 料液比對總黃酮提取率的影響曲線Fig.4 Influence of solid-liquid ratio on total flavones extraction rate

2.2 正交實驗

由表2結(jié)果可知，各因素對總黃酮提取率的影響程度依次為:B＞A＞C＞D，即:提取溫度＞提取時間＞酶用量＞料液比。最佳提取條件為A2B2C2D3，即:提取時間為90min，提取溫度為55℃，酶用量為4mg/g，料液比為 1∶50(g/mL)。

表2 L9(34)正交實驗結(jié)果表Table 2 Results of orthogonal test

2.3 驗證實驗

選用最佳提取條件組:提取時間90min，提取溫度55℃，纖維素酶用量4mg/g，料液比1∶50(g/mL)重復實驗3次，進行驗證，實驗數(shù)據(jù)見表3，3次實驗的平均提取率為2.45%。

表3 正交實驗優(yōu)化條件下總黃酮提取率Table 3 Total flavones extraction rate under optimal condition with orthogonal test

由表3可知，A2B2C2D3條件下冬棗葉中總黃酮的提取率高于表2中的最高提取率(2.3040%)，故A2B2C2D3為最優(yōu)化實驗條件。

2.4 對比實驗

在最佳工藝條件下，分別采用乙醇浸提法(提取溫度80℃，提取時間4h，料液比1∶20(g/mL))和酶解法(提取溫度55℃，提取時間 90min，料液比1∶50(g/mL)，酶用量4mg/g)提取冬棗葉中的總黃酮，測定含量，比較提取率。

表4 提取工藝對總黃酮提取率的影響Table 4 Influence of extraction technologies on total flavones extraction rate

由表4可見，在最佳條件下，酶解法的提取率為2.45%，乙醇浸提法的提取率為1.32%。可見，相對于乙醇浸提法而言，酶解法可降低提取溫度，縮短提取時間，提高冬棗葉中總黃酮的提取率。

3 結(jié)論

本文采用纖維素酶提取冬棗葉中的總黃酮，在單因素實驗的基礎上，進行了多因素正交實驗，確定了纖維素酶提取冬棗葉中總黃酮的最佳工藝條件，即:料液比 1∶50(g/mL)，提取溫度 55℃，提取時間90min，酶用量4mg/g。在最佳提取條件下，提取率可達2.45%。同時得到各影響因素對冬棗葉中總黃酮提取率的顯著性影響順序為:提取溫度＞提取時間＞酶用量＞料液比。

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