陳光斌，蔣玉梅，*，李 紅，肖 俠，邵威平，康開萍

(1.甘肅農(nóng)業(yè)大學食品科學與工程學院，甘肅蘭州730070;2.中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院，北京100027)

固定化酵母技術應用于啤酒連續(xù)后發(fā)酵可以大大減少啤酒后發(fā)酵的時間，從而降低了生產(chǎn)成本。但同時也存在諸多問題，例如如何對不同載體的性能進行有效的評價;載體材料成本較高，以至難以在發(fā)酵工業(yè)中推廣等［1］。近年來國內(nèi)外均有學者使用不同載體對固定化連續(xù)發(fā)酵進行了研究:程江峰以陶瓷，楊秋明以海藻酸鈉，石小霞等人及李濤等人以海藻酸鈉-聚乙烯醇，陳功等以聚乙烯醇(PVA)與陰離子交換樹脂(苯乙烯型)混合制成的生物膜，Linko等、Kronlof等以山毛櫸木片，Tomas Branyik等以玉米芯作為載體，分別對固定化技術以及固定化連續(xù)發(fā)酵進行了研究［2-11］。本文使用價格低廉的山毛櫸木片和多孔陶瓷作為固定酵母載體，對這兩種載體在固定化連續(xù)后發(fā)酵中的固定化效果，以及生產(chǎn)的啤酒的各指標進行比較研究，從而對固定化載體的性能進行有效的評價，并為選出較優(yōu)載體提供了理論基礎。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

菌株Saccharomyces cerevisiae由中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院菌種保藏中心提供;山毛櫸木片 其主要參數(shù)約為:長×寬×高(0.8cm×0.5cm×0.12cm);多孔陶瓷 其主要參數(shù)約為:長×寬×高(1.0cm×0.8cm×0.6cm);嫩啤酒 10°P麥汁經(jīng)大罐主酵后的發(fā)酵液，要求可發(fā)酵浸出物含量不高于5%，中國食品發(fā)酵工業(yè)研究院提供。

固定床反應罐 反應罐帶有夾套，用水制冷，反應罐容積為，徑高比為1∶4，自制;UV-2401PC紫外分光光度計 日本島津公司;高效液相色譜 日本島津公司;Auto system XL氣相色譜儀 美國PerkinElmer公司;HY-5型回旋式振蕩器 上海京工實業(yè)有限公司;pHS-3C精密pH計 上海自動化儀表公司;HX-105恒溫水浴箱 上?？戮S儀器有限公司;HL-ZS恒流泵 保定蘭格恒流泵有限公司。

1.2 分析方法

酵母數(shù)測定采用血球計數(shù)法;揮發(fā)性物質(zhì)的測定采用氣相色譜自動頂空進樣;雙乙酰含量測定采用蒸餾比色法［12］;酒精含量測定采用蒸餾-比重法;氨基酸測定采用液相色譜法。

1.3 實驗方法

1.3.1 測定兩種載體的固定酵母量 兩種載體經(jīng)沸水蒸煮4h，取出木片然后浸入10%乙醇中2h，取出載體再在沸水中蒸煮 1h［13］。

取20g經(jīng)上述處理后的濕山毛櫸木片(多孔陶瓷)加入250mL三角瓶中，向三角瓶中加入200mL酵母液，酵母液濃度為5×106個/mL，用封口膜封口，固定吸附條件如下溫度為20℃，搖床轉速為80r/min，固定時間為12h。

在600nm下測定吸光度［14］，通過酵母-吸光度的標準曲線換算出三角瓶液體中的酵母濃度，從而可知載體上酵母數(shù)量。

1.3.2 測定兩種載體固定化酵母的速率 固定化酵母達到飽和時的速率即為載體的固定化酵母的速率，測定酵母飽和的時間及飽和時載體上的酵母數(shù)，測定酵母數(shù)方法同1.3.1。

1.3.3 測定兩種載體固定化酵母的牢固程度 傾去三角瓶中剩余的酵母液;用50mL無菌蒸餾水沖洗載體，載體浸入液面以下持續(xù)10s后，小心傾去液體。重復操作4次(共沖洗5次);于上述三角瓶中加入100mL無菌蒸餾水，于搖床中200r/min回旋振蕩，分別測定振蕩0.5、1、2、3、4min 時溶液的吸光度。

1.3.4 固定化連續(xù)發(fā)酵操作 進行循環(huán)固定化操作。固定化條件如下:時間為12h，溫度為20℃，設定線速度為1.7×10-2cm/s。

取主發(fā)酵第5d發(fā)酵液，經(jīng)3000r/min離心10min后，再經(jīng)80℃水浴加熱10min，迅速冷卻至室溫，進行固定化發(fā)酵，發(fā)酵在自制反應器中進行，發(fā)酵條件如下:發(fā)酵溫度10℃，滯留時間3.1h。

1.3.5 測定山毛櫸木片和多孔陶瓷作為載體生產(chǎn)的啤酒的各項指標 連續(xù)后發(fā)酵完畢后，測定酒液的重要風味物質(zhì)與氨基酸等理化指標。

1.3.5.1 樣品預處理 發(fā)酵液以5000r/min的速度離心10min，取5mL上清液于20mL頂空瓶中，蓋上膠塞，用鋁制瓶塞密封，自動進樣。

1.3.5.2 色譜條件 色譜柱:DM-WAXETR色譜柱(30m ×0.53mm ×1μm);載氣:氮氣(8mL/min);進樣口參數(shù):溫度:200℃，分流比5∶1;檢測器參數(shù):溫度:250℃，氫氣45mL/min;空氣:450mL/min;升溫程序:35℃保溫3min，以10℃/min的速度升溫至60℃保溫0min，20℃/min的速度升至120℃，再以40℃/min的速度升至200℃保溫0min。

2 結果與分析

2.1 酵母－吸光度標準曲線的繪制

酵母-吸光度標準曲線見圖1。

圖1 酵母-吸光度標準曲線Fig.1 Yeast-absorbance standard curve

2.2 兩種載體的固定酵母量的比較

由圖2中可知，兩種載體固定酵母能力差異顯著(p＜0.05)，山毛櫸木片固定化酵母的量比多孔陶瓷固定量高出31.2%。

圖2 兩種載體的固定酵母量Fig.2 The amount of the immobilized yeast by the two carriers

2.3 兩種載體的固定化酵母速率的比較

由圖3中可知，兩種載體固定化酵母速率差異顯著(p＜0.05)，山毛櫸木片固定化酵母達到飽和時速率比多孔陶瓷固定化酵母達到飽和時速率高45.4%。

圖3 兩種載體在達到飽和時固定化酵母的速率Fig.3 The rate of the immobilized yeast by the two carriers when they saturated

2.4 兩種載體固定化酵母的牢固程度的比較

分析圖4可知，初始時山毛櫸木片上固定酵母的量高于多孔陶瓷上固定酵母的量，隨著時間的變化，山毛櫸木片與多孔陶瓷上振蕩下來的酵母量逐漸增多，0～0.5min期間，山毛櫸木片振蕩下來的酵母量低于多孔陶瓷上振蕩下來的酵母量;0.5～2min期間，兩種載體上振蕩下來的酵母量基本持平;而2～4m in期間山毛櫸木片上振蕩下來的酵母量高于多孔陶瓷上振蕩下來的酵母量，這是由于多孔陶瓷上的酵母在0～2m in時大部分均已被振蕩下來，而2m in時山毛櫸木片上仍固定著一部分酵母。4m in時兩載體上固定的酵母完全被振蕩下來。因此，可知山毛櫸木片固定化酵母的牢固程度優(yōu)于多孔陶瓷。

圖4 山毛櫸木片與多孔陶瓷固定化的酵母的牢固程度Fig.4 The stability of the immobilized yeast by the two carriers

2.5 兩種載體固定化連續(xù)后發(fā)酵生產(chǎn)的酒的各項理化指標的比較

由表1可知，分別以山毛櫸木片與多孔陶瓷作為載體后發(fā)酵生產(chǎn)的啤酒中雙乙酰含量差異顯著(p＜0.05)，其余指標差異不顯著(p＞0.05)。而且以木片為載體生產(chǎn)的啤酒中雙乙酰含量低于以多孔陶瓷為載體生產(chǎn)的啤酒中的含量，這可能是由于載體木片上酵母量多于多孔陶瓷上的酵母量，從而使其生產(chǎn)的啤酒中更多的雙乙酰被還原。

表1 兩種載體固定化連續(xù)后發(fā)酵生產(chǎn)的酒的指標Table 1 The indexes of the fermented beer by the two carriers

由表2可知，分別以山毛櫸木片與多孔陶瓷作為載體后發(fā)酵生產(chǎn)的啤酒中，其乙醛、甲酸乙酯、乙酸乙酯、正丙醇、異丁醇、乙酸異戊酯、異戊醇的差異性顯著(p＜0.05)，其余風味物質(zhì)的差異不顯著(p＞0.05)。而且以山毛櫸木片為載體生產(chǎn)的啤酒中乙醛含量低于以多孔陶瓷為載體生產(chǎn)的啤酒中的含量。

由表3可知，分別以山毛櫸木片與多孔陶瓷作為載體后發(fā)酵生產(chǎn)的啤酒中，酪氨酸、亮氨酸含量差異不顯著(p＞0.05)，其余氨基酸含量差異性顯著(p＜0.05)。

表2 兩種載體固定化連續(xù)后發(fā)酵啤酒的風味物質(zhì)含量(mg/L)Table 2 Flavor substances of the fermented beer by the two carriers(mg/L)

表3 兩種載體固定化連續(xù)后發(fā)酵啤酒的氨基酸含量(mg/L)Table 3 The content of amino acids of the fermented beer by the two carriers(mg/L)

3 結論

對山毛櫸木片和多孔陶瓷兩種載體在固定化連續(xù)后發(fā)酵中固定化酵母的效果以及生產(chǎn)的啤酒的各項理化指標進行比較和研究。結果表明:山毛櫸木片的固定化酵母的能力、固定化酵母達到飽和時的速率、固定化酵母的牢固程度均優(yōu)于多孔陶瓷。

分別以山毛櫸木片與多孔陶瓷作為載體后發(fā)酵生產(chǎn)的啤酒中雙乙酰含量差異顯著(p＜0.05)，其余指標差異不顯著(p＞0.05);而且以山毛櫸木片為載體生產(chǎn)的啤酒中雙乙酰含量低于以多孔陶瓷為載體生產(chǎn)的啤酒中的含量。風味物質(zhì)中，乙醛、甲酸乙酯、乙酸乙酯、正丙醇、異丁醇、乙酸異戊酯、異戊醇的差異顯著(p＜0.05)，其余風味物質(zhì)的差異不顯著(p＞0.05);而且以山毛櫸木片為載體生產(chǎn)的啤酒中乙醛含量低于以多孔陶瓷為載體生產(chǎn)的啤酒中的含量。氨基酸含量中，酪氨酸、亮氨酸含量差異不顯著(p＞0.05)，其余氨基酸含量差異性顯著(p＜0.05)。

綜合結果表明，山毛櫸木片固定化酵母能力及其生產(chǎn)的啤酒的品質(zhì)均優(yōu)于多孔陶瓷。

［1］張超，王立，固定化細胞應用進展［J］.微生物學雜志，2006，26(4):82-84.

［2］程江峰，何國慶.蜂窩陶瓷固定化酵母細胞啤酒連續(xù)主發(fā)酵工藝［J］.過程工程學報，2003，3(5):419-422.

［3］程江峰，何國慶.固定化酵母細胞啤酒連續(xù)后發(fā)酵工藝條件的優(yōu)化［J］.中國食品學報，2004，4(2):31-34.

［4］楊秋明，郭彩華，蔡慧農(nóng)，等.耐鹽酵母固定化方法的初步研究［J］.食品與發(fā)酵工業(yè)，2010，36(6):85-88.

［5］石小霞，褚可成，陳志梅.固定化細胞技術及其應用［J］.食品工業(yè)科技，2010，31(12):380-382.

［6］李濤，陸健，蔡國林.利用固定化酵母進行啤酒連續(xù)主發(fā)酵的初步研究［J］.中國釀造，2010，221(8):14-17.

［7］陳功，王聯(lián)結.PVA膜固定化酵母發(fā)酵酒精的研究［J］.食品科學，2007，28(8):244-246.

［8］葉生梅，曠瑞，耿陳龍，等.固定化酵母發(fā)酵啤酒實驗研究［J］.食品科技，2011，36(8):123-126.

［9］Linko M，Virkajarvi I，et al.Main fermentation with immobilized yeast—a break-through.Proceedings of the 26th Congress of European Brewers’Convention［C］.Maastricht IRL Oxford，1997:385-394.

［10］Kronlof J，Virkajarvi I.Primary fermentation with immobilised yeast.In Proceedings of the Congress of the European Brewery Convention［C］.Cannes，1999:761-770.

［11］Tomas B，Daniel P，Silva，et al.Continuous immobilized yeast reactor system for complete beer fermentation using spent grains and corncobs as carrier materials［J］.Journal of Industrial Microbiology and Biotechnology，2006，33(12):1010-1018

［12］管敦儀 .啤酒工業(yè)手冊［M］.北京:中國輕工業(yè)出版社，1998.

［13］Razmovski R，Pwjin D.Immobilization ofsaccharomyces diastaticuson wood chips for ethanol production［J］.FolIa Microbiol，1996，41(2):201-207.

［14］Catarina A，Tomas B.Continous production of pectinase by immobilized yeast cells on spent grains［J］.Journal of Bioscience and Bioengineering，2003，96(6):513-518.