米書梅，阮 征，溫艷梅，周 艷，張 翠，劉文群，印遇龍，3，江 波，*

(1.南昌大學(xué)食品科學(xué)與技術(shù)國家重點實驗室，江西南昌330047;2.南昌大學(xué)生命科學(xué)與食品工程學(xué)院，江西南昌330031;3.中國科學(xué)院亞熱帶農(nóng)業(yè)生態(tài)研究所，湖南長沙410125)

水果和蔬菜是人類的主要食物來源之一，它們不僅提供維生素、礦物質(zhì)和膳食纖維等營養(yǎng)成分，而且近年來研究表明攝食水果蔬菜還能夠預(yù)防退行性疾病尤其是心血管疾病、癌癥等發(fā)生［1］。這歸功于其中存在的多種功能性物質(zhì)，如酚類化合物、類胡蘿卜素、纖維素等，其中酚類物質(zhì)尤其重要，其抗氧化效果甚至強于眾所周知的維生素C(Vitamin C，VC)、維生素E、β-胡蘿卜素等［2］。了解果蔬的抗氧化活性對于人們能合理利用營養(yǎng)物質(zhì)，研制預(yù)防癌癥等老年疾病的功能食品非常重要［3］。Eberhart等［4］證實水果和蔬菜中植物性化學(xué)物質(zhì)的綜合作用是它們強大的抗氧化功能和抗癌活性的關(guān)鍵，比單獨提取的抗氧化成分效果更佳。近年研究表明，對食物整體抗氧化能力的認識不足，忽略了食物中各種成分的相互作用及其對抗氧化能力的影響［5］。果蔬中抗氧化活性物質(zhì)種類多樣，包括維生素，多酚以及黃酮等［6］，國內(nèi)外對果蔬抗氧化能力與活性物質(zhì)進行了大量的研究。張傳玉等［7］研究了不同品種的水稻中VC的含量以及VC與水稻的抗氧化關(guān)系，發(fā)現(xiàn)VC含量與水稻抗氧化作用可能存在密切的聯(lián)系，并進一步證實VC在水稻的抗氧化脅迫中的重要作用。陳偉等［8］研究發(fā)現(xiàn)蔬菜、水果的抗氧化活性與總黃酮含量具有一定的相關(guān)性，但不同種類的蔬菜和水果，相關(guān)性有一定的差異。Padilla FC等［9］研究了一些種子、堅果和谷物食品的多酚含量以及抗氧化活性，發(fā)現(xiàn)多酚含量與抗氧化活性有一定的相關(guān)性。陳金娥等［10］用鉬酸銨分光光度法測定10種蔬菜中VC的含量，用DPPH法對比研究生熟蔬菜的抗氧化性，證實VC含量與其抗氧化性呈現(xiàn)一定的量效關(guān)系。因此，由以上研究結(jié)果可以看出，對果蔬抗氧化的研究主要集中在某一類活性成分與抗氧化活性的相關(guān)性，然而不同的活性成分對果蔬整體抗氧化能力的影響各不相同，在同一體系中對不同活性成分與抗氧化活性相關(guān)性的認識不足。本實驗運用常見的五種抗氧化測定方法對我國常見的10種果蔬的抗氧化活性進行比較;運用Folin-Ciocalteus法和2，4-二硝基苯肼法測定果蔬中多酚類、VC含量，并且分析、比較了抗氧化活性與多酚類化合物和VC含量的相關(guān)性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

卷心菜、胡蘿卜、洋蔥、茄子、豆角、橘子、香蕉、蘋果、葡萄、西瓜 于8月份購自南昌市天虹超市;羥自由基、超氧陰離子自由基測定試劑盒 由南京建成生物工程研究所提供;DPPH(1，1-二苯-2-苦肼基)、ABTS［2，2-聯(lián)氨-二(3-乙基-苯噻唑-6-磺酸)］、TPTZ(三吡啶三吖嗪)、沒食子酸標(biāo)品 美國Sigma-Aidrich公司;VC廣州鑫昌生物科技有限公司;濃硫酸、濃磷酸、無水乙醇、氯化鐵、鎢酸鈉、鉬酸鈉、碳酸鈉、氫氧化鈉、草酸、硫脲、冰乙酸等 國產(chǎn)分析純。

SC-3614臺式離心機 科大創(chuàng)新股份有限公司中佳分公司;AL104分析天平 梅特勒-托利多儀器(上海)有限公司;722E可見分光光度計 上海光譜儀器有限公司;數(shù)顯恒溫水浴鍋 江蘇城西曉陽電子儀器廠。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品采集與處理 所有樣品均用自來水、蒸餾水反復(fù)沖洗干凈，取日常食用部位若干克，切碎后按1∶9比例(質(zhì)量體積比)加入蒸餾水搗碎。去果蔬組織勻漿液于4800r/min離心15min，上清液分別測定果蔬水提液。果蔬水提液分別測定抗氧化活性、VC、總酚含量，如果樣品濃度過高，適當(dāng)稀釋，平行測定3次。

1.2.2 抗氧化活性測定

1.2.2.1 DPPH法 參考Mezadri等的方法［11］稍做調(diào)整。DPPH工作液:準(zhǔn)確稱取25mg DPPH，溶解于500mL無水乙醇中，置于棕色瓶中，在4℃避光保存。吸取待測樣品0.5mL，加入2.5mL DPPH工作液，漩渦振蕩混勻，避光37℃水浴30min，在517nm下測吸光度。以VC為標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-0.0471x+0.7904(R2=0.9995)，樣品抗氧化活性以AEAC/100g(每100g物質(zhì)的抗氧化能力相當(dāng)于VC(mg)的抗氧化能力)表示。

1.2.2.2 ABTS法 參考 Biglar和 Easa的方法［12］稍做調(diào)整。ABTS工作液:10mL 0.22mmol/L ABTS，10mL 0.2623mmol/L過硫酸鉀，混合避光過夜，制取ABTS自由基。使用時用pH7.4的磷酸鹽緩沖液稀釋40倍。取0.5mL待測樣品，加入2.5mL ABTS工作液，漩渦振蕩混勻，避光37℃水浴30min，在746nm下測吸光度。以VC為標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-0.0418x+0.9961(R2=0.9994)，樣品抗氧化活性以AEAC/100g(每100g物質(zhì)的抗氧化能力相當(dāng)于VC(mg)的抗氧化能力)表示。

1.2.2.3 FRAP法 參考Benzie和Strain的方法［13］稍做調(diào)整。FRAP工作液:由0.3mol/L醋酸鹽緩沖液25mL 10mmol/L TPTZ 溶液 2.5mL，20mmol/L FeCl3溶液2.5mL組成。取0.5mL某待測樣品，加入2.5mL FRAP工作液混勻后37℃反應(yīng)30min，593nm測定吸光度，以VC為標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.0084x+0.0169(R2=1)，樣品抗氧化活性以AEAC/100g(每100g物質(zhì)的抗氧化能力相當(dāng)于VC(mg)的抗氧化能力)表示。

1.2.2.4 清除超氧陰離子自由基 采用南京建成生物工程研究所清除羥自由基測定試劑盒進行測定。

抑制超氧陰離子自由基能力(U/L)=(對照管OD-測定管OD)/(標(biāo)準(zhǔn)管OD-空白管OD)×標(biāo)準(zhǔn)管濃度(0.15mg/mL)×1000mL/(取樣量×稀釋倍數(shù))

1.2.2.5 清除羥自由基 采用南京建成生物工程研究所清除羥自由基測定試劑盒進行測定。

抑制羥自由基能力(U/L)=(對照管OD-測定管OD)/(標(biāo)準(zhǔn)管OD-空白管 OD)×標(biāo)準(zhǔn)管濃度(8.824mmol/L)×1000mL/(取樣量×稀釋倍數(shù))

1.2.3 多酚含量的測定 采用Folin-Ciocalteu法測果蔬中的多酚，參考Hao Zhang等的方法［14］稍做調(diào)整。吸取1mL待測樣品，加入Folin-Ciocalteu顯色劑1mL放置5min后，加入10%碳酸鈉溶液3mL，1min后用蒸餾水定容到10mL。37℃水浴30min后，在764nm波長下測定樣品的吸光度，同時以沒食子酸為標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.0186x+0.022(R2=0.9996)，根據(jù)沒食子酸標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度(C)與吸光度值(A)計算多酚含量。

1.2.4 VC含量的測定 依照 GB/T 5009.86-2003［15］主要步驟:取適量樣品加等量2%草酸溶液勻漿，取勻漿液用1%草酸溶液定容至100mL混勻過濾。濾液中加入活性炭，用力振搖1min，過濾即得樣品氧化液。加等量2%硫脲溶液，混勻得到樣品濾液。加入二硝基苯肼和85%硫酸形成橘紅色化合物之后，測定其在490nm下的吸光度。以VC為標(biāo)準(zhǔn)品做標(biāo)準(zhǔn)曲線，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=0.5274x+0.0142(R2=0.9999)。

表1 蔬菜、水果提取液的抗氧化評價Table 1 Antioxidant activities of the extract of vegetables and fruits

表2 五種方法相關(guān)分析Table 2 Correlation analysis of fivemethods

1.3 數(shù)據(jù)處理與分析

2 結(jié)果與討論

2.1 果蔬抗氧化活性測定及相關(guān)分析

由表1可知，DPPH法抗氧化能力從高到低依次為豆角＞橘子＞洋蔥＞蘋果＞香蕉＞葡萄＞茄子＞卷心菜＞胡蘿卜＞西瓜;ABTS法抗氧化能力從高到低依次為豆角＞洋蔥＞橘子＞香蕉＞茄子＞蘋果＞葡萄＞卷心菜＞胡蘿卜＞西瓜;FRAP法抗氧化能力從高到低依次為橘子＞豆角＞洋蔥＞葡萄＞蘋果＞卷心菜＞香蕉＞茄子＞胡蘿卜＞西瓜。超氧陰離子自由基的測定結(jié)果差異極大，香蕉最強為2855.01U/L，胡蘿卜的清除能力最弱為11.15 U/L，兩者相差258倍。橘子清除羥自由基能力最強8553.03U/L，卷心菜清除能力為1333.59U/L。

5種方法所采用的試劑不同，作用底物也不同。因此為得到適合評價果蔬抗氧化能力的方法，我們還需要對結(jié)果進行進一步的分析。采用SPSS分析軟件進行分析，結(jié)果見表2。DPPH、ABTS和FRAP的相關(guān)性較好，相關(guān)系數(shù)都在0.7103以上，其中，DPPH法和 ABTS法的相關(guān)性最好，相關(guān)系數(shù)為0.9315。超氧陰離子自由基和羥自由基與其他方法相關(guān)性都很差，DPPH、ABTS和FRAP與羥自由基和超氧陰離子自由基的相關(guān)系數(shù)都在0.4521以下。出現(xiàn)上述結(jié)果的原因可能是由于反應(yīng)機理不同。DPPH、ABTS是基于單電子轉(zhuǎn)移(SET)反應(yīng)機制的抗氧化評價方法，能夠反映體外清除自由基的能力［16］;而FRAP是通過氧化還原能力來反映物質(zhì)總抗氧化的活性;且這三種方法操作簡易，重現(xiàn)性好。羥自由基和超氧陰離子法能直觀反映抗氧化活性物質(zhì)對體內(nèi)自由基的清除能力，但步驟較為繁瑣，且重現(xiàn)性差，不適合天然產(chǎn)物抗氧化活性的批量測定。綜上所述，DPPH、ABTS、FRAP較為適合評價果蔬抗氧化能力。

2.2 蔬菜、水果中的總酚和VC含量

由表3可以看出:洋蔥的總酚含量最高，GAE為35.98mg/100g，而西瓜的總酚含量最低，僅為5.87mg/100g，最高與最低之間相差6.13倍。橘子的VC含量最高，為31.06mg/100g，而茄子的 VC含量最低，為4.15mg/100g，最高與最低之間相差7.48倍。陳玉霞等［17］測定常見的 25種蔬菜的總酚含量，藕最高(305mg/100g)，芹菜最低(10.97mg/100g);VC含量，甜椒最高(90mg/kg)，茄子最低(1.0mg/kg)。方敏等［18］對15種水果和33蔬菜VC含量進行測定，紅辣椒、青椒和苦瓜含量最高;胡蘿卜、蘑菇最低。本研究與上述結(jié)果有一定差異，原因可能是果蔬的品種、產(chǎn)地不同，保存時間不同;還可能是采用的測定方法有所差別。

2.3 果蔬總抗氧化活性與多酚和VC的相關(guān)性

經(jīng)SPSS軟件進行相關(guān)、回歸分析，結(jié)果見表4。由相關(guān)系數(shù)(R)可以看出DPPH、ABTS法測得的總抗氧化活性與多酚含量間存在較強的相關(guān)性，相關(guān)系數(shù)分別為0.884、0.848，而FRAP法測得的總抗氧化活性與多酚含量相關(guān)性相對較差，相關(guān)系數(shù)為0.547?？赡茉?FRAP法原理與DPPH、ABTS法不同而引起的差異，從表2五種方法相關(guān)性分析里也可以看出，F(xiàn)RAP法與 ABTS、DPPH法相關(guān)性不如DPPH法與ABTS法的相關(guān)性好。三種方法測得的總抗氧化活性與VC含量的相關(guān)性都較弱，而由回歸系數(shù)(R2)可以看出多酚含量的增加要比VC含量增加引起果蔬總抗氧化活性增加要大，由此可見，果蔬中的多酚比VC對果蔬抗氧化活性的影響要大。

表3 蔬菜、水果中的總酚和VC含量Table3 PhenolicsandVitaminCofvegetablesandfruits

表4 果蔬總抗氧化活性與多酚和VC的相關(guān)性Table4 Correlationanalysisofantioxidantacticityoffruits andvegetablesandphenolicsandVitaminC

郭長江等［19］人認為大多數(shù)蔬菜的抗氧化活性來源于VC以外的抗氧化成分。Maisuthisakul等人認為植物體內(nèi)的抗氧化活性主要是由酚類物質(zhì)提供的，酚類物質(zhì)與抗氧化活性直接相關(guān)［20］。我們的研究結(jié)果也表明:果蔬的抗氧化活性與多酚之間存在著很強的相關(guān)性，而與VC之間的相關(guān)性較弱，說明這些果蔬的抗氧化活性主要由多酚提供。同時VC與多酚之間的相關(guān)性也較弱，說明果蔬中多酚的含量與VC的含量之間沒有很大的關(guān)系。

3 結(jié)論

由于果蔬抗氧化物質(zhì)的多樣性，在評價果蔬抗氧化能力時需采用多種方法進行綜合評定。通過DPPH、ABTS以及FRAP這三種方法檢測果蔬抗氧化活性，并與多酚和VC含量進行相關(guān)性分析，其結(jié)果可以看出果蔬的抗氧化活性與多酚類物質(zhì)具有較強的相關(guān)性，與VC之間的相關(guān)性較弱，說明多酚對果蔬抗氧化能力的影響強于VC。由于食物整體的復(fù)雜性，活性物質(zhì)的多樣且含量不一，全部檢測很不現(xiàn)實，加之物質(zhì)-物質(zhì)相互作用也將影響到抗氧化能力，因此找出影響食物整體抗氧化能力的主要物質(zhì)很有必要。該文比較了多酚和VC對果蔬抗氧化活性的影響，發(fā)現(xiàn)多酚較之VC對果蔬抗氧化作用大。本研究為進一步探討對果蔬抗氧化能力起決定性作用的主要物質(zhì)，以及進一步研究其他活性成分與主要物質(zhì)的相互作用對抗氧化能力的影響打下基礎(chǔ)。

［1］田迪英，楊榮華.果蔬抗氧化活性與總酚含量相關(guān)性研究［J］.化學(xué)世界，2004(2):70-73.

［2］PodsedekA.Naturalantioxidantandantioxidantcapacityof Brassicavegetables:Areview［J］.LWT-FoodScienceand Technology，2007，40(1):1-11.

［3］LiuRH.Healthbenefitsoffruitandvegetablesarefrom additiveandsynergisticcombinationsofphytochemicals［J］.The AmericanJournalofClinicalNutrition，2003，78(3):517-520.

［4］EberhartMV，LeeCY，LiuRH.Nutrition-Antioxidantactivity offreshapples［J］.Nature，2000，6789(405):903-904.

［5］ImMH，ParkYS，LeontowiczH，etal.Thethermostability，bioactivecompoundsandantioxidantactivityofsomevegetables subjectedtodifferentdurationsofboiling:Investigationinvitro［J］.LWT-FoodScienceandTechnology，2011，44(1):92-99.

［6］NunezSellesAJ.Antioxidanttherapy:Mythorreality?［J］.JournaloftheBrazilianChemicalSociety，2005，16(4):699-710.

［7］張傳玉，張執(zhí)金，黃榮峰，等.水稻品種中VC含量及抗氧化性的比較分析［J］.中國農(nóng)業(yè)科技導(dǎo)報，2011，13(6):6-11.

［8］陳偉，曹杰，張瑩，等.蔬菜水果的抗氧化活性與總黃酮含量的相關(guān)關(guān)系［J］.食品營養(yǎng)與衛(wèi)生，2010，37(7):1245-1247.

［9］PadillaFC，RinconAM，Bou-RachedL.Polyphenolcontent andantioxidantactivityofseveralseedsandnuts［J］.Archivos LatinoamericanosDeNutricion，2008，58(3):303-308.

［10］陳金娥，李冬梅，趙戌利，等.10種生、熟蔬菜中VC含量及抗氧化性對比研究［J］.食品科技，2012，37(4):57-59.

［11］MezadriT，Villa?oD，F(xiàn)ernandez-PachonMS，etal.Antioxidantcompounds and antioxidantactivity in acerola(MalpighiaemarginataDC.)fruitsandderivatives［J］.Journalof FoodCompositionandAnalysis，2008，21(4):282-290.

［12］VandenBergR，HaenenGuidoRMM，BergH，etal.The predictivevalueoftheantioxidantcapacityofstructurallyrelated flavonoidsusing the Trolox equivalentantioxidantcapacity(TEAC)assay［J］.FoodChemistry，2000，70(3):391-395.

［13］BenzieIFF，StrainJJ.Theferricreducingabilityofplasmaas ameasureofantioxidantpower:theFRAPassay［J］.Analytical Biochemistry，1996，239(1):70-76.

［14］ZhangH，JiangL，RenFZ，etal.Systematicevaluationof antioxidantcapacitiesoftheethanolicextractofdifferenttissuesof jujube(ZiziphusjujubaMill.)fromChina［J］.FoodandChemical Toxicology，2010，48(6):1461-1465.

［15］GB/T5009.86—2003 中國標(biāo)準(zhǔn)書號［S］.北京:中國標(biāo)準(zhǔn)出版社，2003.

［16］曾軍，石國榮.天然產(chǎn)物抗氧化活性的測定方法和原理［J］.安徽農(nóng)學(xué)通報，2008，14(22):35-36.

［17］陳玉霞，郭長江，楊繼軍，等.常見25種蔬菜抗氧化活性的比較研究［J］.河南工業(yè)大學(xué)學(xué)報，2007，28(5):37-40.

［18］方敏，王耀峰，宮智勇.15種水果和33種蔬菜的抗氧化活性研究［J］.食品科學(xué)，2008，29(10):97-100.

［19］郭長江，韋京豫，楊繼軍，等.66種蔬菜、水果抗氧化活性的比較研究［J］.營養(yǎng)學(xué)報，2003(25):203-207.

［20］MaisuthisakulP，Pongsawatm anitR，Gordon MH.Characterizationofthephytochemicalsandantioxidantproperties ofextractsfromteam(CratoxylumformosumDyer)［J］.Food Chem，2007，100:1620-1629.