成 芳，閆 欣，李 偉，2，*，曲 敏，佟長青，金 橋

(1.遼寧省水產(chǎn)品加工及綜合利用重點開放實驗室，大連海洋大學食品工程學院，遼寧大連116023;2.張家界(中國)金馳大鯢生物科技有限公司，湖南張家界427400)

中國大鯢(Andrias davidianusBlanchard)，它的叫聲像幼兒哭聲，因此人們又叫它“娃娃魚”。屬兩棲綱、有尾目、隱鰓鯢科，是我國特有的大型珍稀兩棲動物［1］。主要分布于長江中上游、珠江中上游及漢水上游的溪流中［2］。大鯢的消化功能十分強大，有很強的耐饑本領(lǐng)，甚至二、三年不吃也不會餓死;它同時也能暴食，飽餐一頓可增加體重的五分之一。隨著人工養(yǎng)殖技術(shù)的發(fā)展，大鯢的開發(fā)利用受到越來越多的關(guān)注［3］。由于大鯢肉味鮮美，營養(yǎng)價值高［4］，所以逐漸成為餐桌上的美味佳肴，而內(nèi)臟則被丟棄。本實驗通過對大鯢胃蛋白酶的相關(guān)研究為大鯢內(nèi)臟的合理回收利用提供理論基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

大鯢胃 2011年10月由張家界(中國)金馳大鯢生物科技有限公司提供;Cellulose DE-52、Sephadex G-100 Sigma公司;牛血清蛋白 北京奧博星生物技術(shù)有限責任公司。

核酸蛋白檢測儀 上?？等A生化儀器制造有限公司;XWT-S系列小型臺式記錄儀 上海自動化儀表股份有限公司;FD-1冷凍干燥機 上海博通經(jīng)貿(mào)有限公司;高效液相色譜儀 大連伊利特分析儀器有限公司;UV-754型紫外可見分光光度計 上海第三分析儀器廠;GL-21M高速冷凍離心機 長沙湘儀離心機儀器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 粗酶液的制備 將大鯢內(nèi)臟用蒸餾水洗凈，濾紙吸去水分稱重，先用剪刀剪碎再用組織搗碎機搗碎，按 1∶5的比例加入磷酸緩沖液(pH7.4，0.01mol/L)，浸泡 4h。離心(9000r/min，4℃)30min取上清液，去沉淀，量筒量體積。用80%硫酸銨沉淀，置于冰箱過夜(4℃)。離心(9000r/min，4℃)30min去上清，收集沉淀，2～3mL磷酸緩沖液溶解沉淀，透析，得到粗酶液。

1.2.2 DEAE-52陰離子交換層析 DEAE-52陰離子交換層析柱按產(chǎn)品說明書要求進行處理，裝柱(2.5cm×13cm)后，用4倍柱床體積(200mL)的蒸餾水平衡，上樣量為4mL。用1mol/L NaCl溶液進行線性梯度洗脫，流速為2mL/min，3mL/管，紫外檢測波長為280nm。測定各管的紫外吸收值和酶活力。收集酶活性較高的各管酶液，透析、冷凍干燥，進行下一步純化。

1.2.3 Sephadex G-100凝膠過濾層析 Sephadex G-100凝膠過濾層析柱按產(chǎn)品說明書要求進行處理，裝柱(2.5cm×100cm)后，用KCl-HCl緩沖液(pH2，0.01mol/L)平衡柱床，上樣量為10mL。用上述緩沖液進行洗脫，流速為3mL/min，3mL/管，紫外檢測波長為280nm。測定各管的紫外吸收值和酶活力。收集酶活性較高的各管酶液，透析、冷凍干燥，進行下一步純化。

1.2.4 HPLC色譜層析 將Sephadex G-100凝膠過濾層析收集得到的活性組分溶于檸檬酸酸緩沖液(Na2HPO4-檸檬酸，0.2mol/L，pH4.0)中，用 0.45μm的微孔濾膜過濾。取20μL上樣進行純化。色譜柱:TSK凝膠色譜柱G4000PWXL(4.6mm×300mm)，柱溫為室溫，流動相為Na2HPO4-檸檬酸緩沖液(0.2mol/L，pH4.0);280nm下紫外檢測。按酶活力測定方法測定，透析，冷凍干燥，得到蛋白酶純品。

1.2.5 胃蛋白酶活力的測定 采用分光光度法，對其稍作修改:取1%酪蛋白1mL加3.9mL KCl-HCl緩沖液(p H2.0，0.01mol/L)于40℃恒溫水浴預熱5min，加入胃蛋白酶液0.1mL反應30min，加入0.5mL 10%TCA(三氯乙酸)終止反應。離心(9000r/min，10min)，取上清測OD280。對照樣是1mL，1%酪蛋白加4mL同樣的緩沖液，40℃恒溫水浴預熱5min，不加酶液，反應30min，加入0.5mL 10%TCA(三氯乙酸)終止反應。離心(9000r/min，10min)。

蛋白酶活力單位為:1mL酶液，在此條件下，每分鐘增加0.001個OD值為一個酶活力單位，以U/mL表示［5］。

1.2.6 蛋白質(zhì)含量測定 按Lowry法［6］進行測定，以牛血清白蛋白為標準樣品。

1.2.7 胃蛋白酶相對分子量的測定 用SDS-PAGE測定其分子量［7］。

1.2.8 溫度和p H對酶活力及其穩(wěn)定性的影響 取0.1mL酶液分別在5～60℃反應，按酶活力測定方法測其OD280。確定其最適溫度。

0.1mL酶液分別在 5～60℃保溫 30min后，在40℃反應30min，加入TCA終止反應。測OD280，以觀察溫度對酶活力穩(wěn)定性的影響。

取0.1mL酶液分別在pH1～6的緩沖液中反應，按酶活力測定方法測其OD280，p H1～2是KCl-HCl緩沖液，pH3是 Na2HPO4-檸檬酸緩沖液，pH4～5是HAc-NaAc緩沖液，pH6是Na2HPO4-NaH2PO4緩沖液。確定其最適pH。

0.1mL酶液分別在 pH1～6的緩沖液中保溫30min后，在40℃反應30min，加入 TCA終止反應。測OD280，以觀察p H對酶活力穩(wěn)定性的影響。

1.2.9 胃蛋白酶的動力學測定 分別配制不同質(zhì)量濃度1.0 ×104、5.0 × 103、2.5 × 103、1.66 × 103、1.25 ×103、1.0 ×103、8.3 ×102、7.14 ×102mg/L 的酪蛋白為底物，在40℃，pH2的條件下按酶活力測定方法測其OD280。用雙倒數(shù)作圖法作圖［8］。

1.2.10 金屬離子、EDTA和化學試劑對蛋白酶活力影響測定 在緩沖液中分別加入5、10mmol/L的Ca2+、Zn2+、Cu2+、Mg2+、Ba2+、Li+、Mn2+、EDTA，以及0～100μmol/L的 BrAc和 0～10μmol/L NBS 抑制劑。按測酶活力的方法測其OD280，觀察金屬離子，EDTA和化學試劑對蛋白酶活力的影響。

2 結(jié)果與分析

2.1 胃蛋白酶的分離純化

粗酶液經(jīng)DEAE-52離子交換層析，NaCl梯度洗脫，得到層析液，測OD280，結(jié)果如圖1所示，有兩個蛋白峰。對其進行酶活力檢測，第二個蛋白峰有酶活力，收集樣品并透析，凍干。之后經(jīng)過Sephadex G-100凝膠過濾層析，對每一個層析管測定OD280，結(jié)果如圖2所示，有兩個蛋白峰。對其進行酶活力檢測，都有蛋白酶活力，且第二個蛋白峰的活力大于第一個蛋白峰。收集第二個蛋白峰，透析，冷凍干燥。

圖1 大鯢胃蛋白酶DEAE-52陰離子交換層析柱層析Fig.1 Ion exchange chromatography of crude pepsin from Andrias davidianus on DEAE-52

將得到的樣品用高效液相TSK凝膠色譜住(G4000PWXL)進行純化。結(jié)果如圖3所示，所得到的蛋白峰為單一對稱層析峰，這表明所提取的蛋白較純。采用酶活力檢測方法檢測到該蛋白峰有活力，收集此峰，透析并凍干。經(jīng)SDS-PAGE電泳，顯示為一條蛋白帶，說明該蛋白酶樣品已經(jīng)達到電泳純，整個酶的分離純化結(jié)果如表1。

圖2 大鯢胃蛋白酶Sephadex G-100分子篩凝膠層析Fig.2 Gel filtration chromatography of pepsin from Andrias davidianus on Sephadex G-100

圖3 高效液相色譜Fig.3 Spectrum of HPLC

表1 大鯢胃蛋白酶的分離結(jié)果Table 1 Purification results of pepsin from Andrias davidianus

2.2 胃蛋白酶相對分子量

通過SDS-PAGE對經(jīng)HPLC后收集的胃蛋白酶分子量進行測定。所得結(jié)果如圖4所示，加入β-巰基乙醇和不加入β-巰基乙醇的情況下均表現(xiàn)為一相對分子量為31ku(數(shù)據(jù)未在圖上顯示)。β-巰基乙醇可以打開-S-S-連接的蛋白質(zhì)亞基，所以大鯢胃蛋白酶不含有-S-S-連接的亞基。

圖4 胃蛋白酶SDS-PAGE電泳Fig.4 SDS-PAGE of pepsin

2.3 溫度和pH對酶活力及其穩(wěn)定性的影響

測定在5～60℃范圍內(nèi)溫度對酶活力及其穩(wěn)定性的影響，以反應條件為 pH2，40℃下測得的活性為100%。結(jié)果如圖5所示，溫度在20～40℃活性較高，最適溫度是40℃;在5～40℃酶活力相對穩(wěn)定，高于40℃酶活力開始下降，60℃時相對酶活性少于20%。

圖5 溫度對胃蛋白酶活力和穩(wěn)定性的影響Fig.5 Effect of temperature on the enzyme activity and stability of pepsin

在p H1～6時測定p H對酶活力及其穩(wěn)定性的影響，以反應條件為pH2，40℃下測得的活性為100%。結(jié)果如圖6所示，pH在2時活性最高，是最適p H。在p H2～6時酶活力相對穩(wěn)定，pH1，酶活力下降為60%。

圖6 pH對胃蛋白酶活力和穩(wěn)定性的影響Fig.6 Effect of pH on the enzyme activity and stability of pepsin

2.4 胃蛋白酶的動力學

通過測定不同底物濃度下的反應速度，可以確定酶催化反應的最大速度Vmax和米氏常數(shù)Km。采用雙倒數(shù)作圖法(Lineweaver-Burk法)，以1/V為縱坐標，1/［S］為橫坐標作圖。如圖7所示，分別得出最大反應速度Vmax和米氏常數(shù)Km。Vmax=2.674μg/min，Km=7.3×103mg/L。

圖7 Lineweaver-Burk圖Fig.7 Lineweaver-Burk

2.5 金屬離子、EDTA和化學試劑對蛋白酶活力影響測定

分別研究不同濃度的 Ca2+、Zn2+、Cu2+、Mg2+、Ba2+、Li+、Mn2+、EDTA 以及化學試劑對蛋白酶活力的影響。

測定不同濃度金屬離子對酶活力的影響，結(jié)果如表2所示，Li+對酶有輕微的抑制作用，Mn2+、Ca2+、Zn2+、Mg2+、Ba2+、Cu2+對酶活力無影響。EDTA 對酶活力有很強的抑制作用。

如圖8～圖9所示，BrAc的濃度范圍為0～80μmol/L時，酶活力緩慢下降，當濃度達到100μmol/L時，酶活性僅剩 9.6%;NBS濃度大于8μmol/L時，酶活性急劇下降。

表2 金屬離子和EDTA對胃蛋白酶活力的影響Table 2 Effect of mental ion and EDTA on activities of pepsin

圖8 BrAc對胃蛋白酶的抑制作用Fig.8 Inhibition of BrAc on pepsin activity

圖9 NBS對胃蛋白酶的抑制作用Fig.9 Inhibition of NBSon pepsin activity

3 討論與結(jié)論

3.1 從大鯢胃中提取的胃蛋白酶經(jīng)四個步驟完成分離純化。粗酶液經(jīng)鹽析法(飽和度80%的(NH4)2SO4沉淀)獲得粗蛋白，將粗蛋白經(jīng)過DEAE-52離子交換層析及Sephadex G-100凝膠過濾層析得到胃蛋白酶，總活力為79.06U，比活力為247.07U/mg，回收率為4.4%，純化倍數(shù)為239.87。將胃蛋白酶經(jīng)HPLC進一步純化，收集到的樣品經(jīng)SDS-PAGE凝膠電泳測定胃蛋白酶分子量約為31ku。在童耕雷［9］所說的胃蛋白酶相對分子量31～36ku的范圍內(nèi)。

3.2 胃蛋白酶是一種酸性蛋白酶，在酸性環(huán)境中，它的穩(wěn)定性較好，它的最適p H是2，與王璋主［10］著作中所講的相一致。本實驗中大鯢胃蛋白酶的最適溫度是40℃，與吳燕燕等［11］的羅非魚腸蛋白酶和李大志等［12］的蝦夷馬糞海膽蛋白酶的最適溫度相似。

3.3 在 pH2，40℃，大 鯢 胃 蛋 白 酶 的 Km為7.3 ×103mg/L，Vmax為 2.674μg/min，Km偏大，與底物的親和力不強?？赡艽篥F的主要食物來源中酪蛋白含量較少。EDTA對大鯢胃蛋白酶有很強的抑制作用，表明大鯢胃蛋白酶有可能是金屬蛋白酶。Sitthipong等［13］研究的金槍魚中，EDTA 對金槍魚的胃蛋白酶影響不大。

3.4 NBS能較專一的修飾蛋白質(zhì)的色氨酸殘基(Trp)［14］。用不同濃度的NBS對酶進行化學修飾，得知在NBS的濃度為2～8μmol/L時，酶活力不受影響，當濃度為10μmol/L時，酶活性急劇下降?？梢?，大鯢胃蛋白酶酶活性中心基團含有色氨酸。BrAc能較專一的修飾蛋白質(zhì)的組氨酸殘基。當BrAc的濃度范圍為20～80μmol/L時，酶活力緩慢下降，當濃度為100μmol/L時，酶活性剩余9.6%，幾乎失活。說明組氨酸是酶活性必需基團之一。通過上述這些研究，得到了一些大鯢胃蛋白酶的性質(zhì)，但還不足以解釋大鯢具有耐饑本領(lǐng)的原因，還需要日后深入研究。

［1］葉昌媛，費梁，胡淑琴.中國珍稀及經(jīng)濟兩棲動物［M］.成都:四川科學技術(shù)出版社，1993:64-69.

［2］李偉，于新瑩，佟長青，等.大鯢粘液酶解產(chǎn)物的制備及其抗疲勞作用研究［J］.食品工業(yè)科技，2011，32(6):146-148.

［3］馬小燕，陳易彬，李彥軍.酶法水解大鯢蛋白的工藝研究［J］.中國釀造，2009，11:92-95.

［4］艾為明，陳少波，曾國權(quán)，等.人工模擬生態(tài)養(yǎng)殖子二代大鯢肌肉營養(yǎng)成分分析［J］.水生態(tài)學雜志，2008，1(2):120-123.

［5］B.施特爾馬赫.酶的測定手冊［M］.北京:中國輕工業(yè)出版社，1992:253-254.

［6］Lowry D H.Protein measurement with the Folin Phenol reagent［J］.JBiol Chem，1951，193:267.

［7］楊安鋼.生物化學與分子生物學實驗技術(shù)［M］.北京:高等教育出版社，2001:248-252.

［8］羅九甫.酶與酶工程［M］.上海:上海交通大學出版社，1996:262-280.

［9］童耕雷.使用生物化學與分子生物學詞典［M］.科學出版社，2003:588-589.

［10］王璋主 .食品酶學［M］.中國輕工業(yè)出版社，1997:188-191.

［11］吳燕燕，李來好，郝志明，等.羅非魚腸蛋白酶的分離純化及其性質(zhì)［J］.水產(chǎn)學報，2010，34(3):357-365.

［12］李大志，李大成，童圣英，等.蝦夷馬糞海膽蛋白酶性質(zhì)研究［J］.遼寧師范大學學報，2002，25(3):301-304.

［13］Sitthipong N，Soottawat B，Hideki K.Biochemical properties of pepsinogen and pepsin from the stomach of albacore tuna(Thunnua alalunga)［J］.Food Chemistry，2010，121(1):49-55.

［14］樊少華，吳珍紅，繆曉青.中華蜜蜂工蜂堿性磷酸酶功能基團的研究［J］.中國蜂業(yè)，2006，57(7):7-9.