肖 艷，牛榮麗

(華僑大學分子藥物研究院，福建廈門361021)

海洋微藻是海洋生態(tài)系統(tǒng)中最主要的初級生產(chǎn)者，它具有種類多、數(shù)量大、繁殖快等特點，在保健食品、藥物、化妝品、生物農(nóng)藥、污水治理等方面有廣泛的應(yīng)用，逐步成為人們關(guān)注的熱點［1］。近年來從海洋微藻中分離提取出多種生物活性物質(zhì)［2］，如從小球藻中提取得到的耐高溫球蛋白和單半乳糖基二?；蛔C明有抗腫瘤作用。對海洋微藻中的抗菌活性物質(zhì)研究發(fā)現(xiàn)，部分脂肪酸及其酯類衍生物有抗菌活性［3-6］，如EPA(二十碳五烯酸)對食品腐敗菌有一定的抗菌活性［7］，但是EPA甲酯的抗菌活性幾乎無報道。本文利用多種提取分離方法，從海洋微藻小球藻中得到EPA甲酯，并將得到的EPA甲酯成分與其他脂肪酸甲酯進行抗菌實驗研究，發(fā)現(xiàn)其抗菌活性最好，并對多種菌表現(xiàn)出抗菌活性。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

海水小球藻粉 盤錦光合蟹業(yè)有限公司提供;金黃色葡萄球菌(ATCC6538P)、大腸桿菌(ATCC8739) 實驗室凍存菌種;枯草芽孢桿菌(10275)、銅綠假單胞菌(10204) 購自中國微生物菌種保藏管理中心;瓊脂、酵母提取物、蛋白胨 生化試劑;氯仿、甲醇、乙醇、丙酮、正己烷、氯化鈉、氫氧化鈉、鹽酸、尿素 購自國藥集團化學試劑有限公司，均為分析純;EPA甲酯標準品，純度≥99% 美國NU-CHEK公司。

GC-6890色譜儀 美國安捷倫公司;GC-MSQP2010聯(lián)用儀 日本島津公司;高壓蒸汽滅菌鍋ZEALWAY;MAXO400搖床 Thermo scientific;HPX-9082 MBE數(shù)顯電熱培養(yǎng)箱 上海博訊實業(yè)有限公司醫(yī)療設(shè)備廠;SW-CJ-IFD潔凈工作臺 蘇凈集團蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司;SHZ-D(Ⅲ)循環(huán)水式真空泵 鞏義市予華儀器有限責任公司;旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海申勝生物技術(shù)有限公司。

1.2 粗脂的提取

取小球藻粉 10g，用氯仿∶甲醇(2∶1，V/V)混合液75mL，于4℃冰箱中浸提16h，過濾，回收溶劑得到浸膏。浸膏中加入50mL 0.88%NaCl水溶液，于分液漏斗中搖勻靜置分層，用圓底燒瓶收集下層有機相，40℃旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)，得到粗脂。

1.3 多不飽和脂肪酸(PUFA)的分離

采用皂化-尿素包合的方法，取上步制得的粗脂，加入40mL 1mol/L NaOH-乙醇，在60℃水浴下皂化1h，室溫冷卻，過濾除皂，用6mol/L HCl調(diào)至pH至1～2，將得到的皂化液加入20mL的正己烷萃取三次，靜置分層，合并有機相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到游離的脂肪酸。取游離脂肪酸，按脂肪酸∶尿素∶甲醇 =1∶3∶9(W/W/V)比例進行實驗。尿素與甲醇于70℃封塞旋轉(zhuǎn)溶解，然后迅速加入脂肪酸，冷卻至室溫后，于4℃下包合24h。將上述冷卻結(jié)束后的尿包樣品，用布氏漏斗迅速抽濾，收集濾液移入分液漏斗中，加入30mL去離子水，分別用20mL的正己烷萃取三次，靜置分層，合并有機相，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)得到多不飽和脂肪酸。

1.4 脂肪酸甲酯的制備

將制得的脂肪酸放入250mL圓底燒瓶中，再加30mL 3N鹽酸-甲醇充分混合，加入幾粒沸石，連接回流裝置，在充氮氣的條件下，70℃加熱回流1h;然后取出冷卻，移入分液漏斗，加入20mL蒸餾水，用10mL正己烷萃取，重復(fù)2次，合并有機相，加無水Na2SO4脫水后抽濾，然后40℃水浴中旋轉(zhuǎn)濃縮，殘液為其脂肪酸甲酯，于4℃冰箱放置，進樣前用正己烷稀釋到100mg/kg左右，精密量取1μL注入氣質(zhì)聯(lián)用色譜儀，記錄色譜圖，按峰面積歸一化法計算各個脂肪酸的含量。

1.5 多不飽和脂肪酸甲酯的純化

稱取1g上述脂肪酸甲酯粗品，加入硝酸銀-硅膠層析柱中［8］，依次用 1%、5%、10%、16%、22%、26%、30%丙酮-正己烷混合溶液兩個柱體積進行洗脫，控制洗脫流速1mL/min，并每10mL收集1次洗脫液，經(jīng)TLC分析，相同部分合并，再經(jīng)氣質(zhì)聯(lián)用色譜測定EPA甲酯的含量。

1.6 GC及GC－MS條件

GC條件:Agilent 19091N-113毛細管柱(30m×0.32mm ×0.25μm)，進樣口溫度 250℃，壓力 10.19psi，分流比 40∶1，程序升溫，從 150℃開始保持 1min，以15℃/min升至200℃，再以2℃/min升至230℃，保持0min。檢測器溫度275℃。H2流量4.5mL/min，空氣流量400mL/min，N2流量1.5 mL/min。

GC-MS條件:Rtx-Wax毛細管柱(30m×0.25mm×0.25μm);載氣:高純氦氣;測定條件:面積歸一化法，進樣口溫度220℃，程序升溫，從150℃開始保持1min，以15℃/min升至200℃，再以2℃/min升至230℃，保持6min。壓力為72.0kpa，分流比為20∶1。質(zhì)譜條件:EI離子源，離子源溫度為220℃，接口溫度250℃。檢測器電壓1.2kv，溶劑延遲2min，掃描范圍45～350。

1.7 抗菌實驗

采用圓形紙片［9］定性實驗測得各脂肪酸甲酯的抑菌圈和試管稀釋法［10］定量實驗測得最小抑菌濃度(MIC)。

2 結(jié)果與討論

2.1 GC及GC－MS結(jié)果

用氣相色譜進行定性分析。如圖1所示EPA甲酯標準品的Rf為10.368。將得到的粗脂、多不飽和脂肪酸及EPA分別進行甲酯化后，進行氣相分析，如圖2～圖4所示。經(jīng)過各步的提取分離純化以后，EPA甲酯的純度在不斷增加，最后得到EPA甲酯的純度可達到98.2%。

圖1 EPA甲酯標準品氣相色譜圖Fig.1 Gas chromatogram of EPA methyl ester

圖2 粗脂甲酯氣相色譜圖Fig.2 Gas chromatogram of fatty acid methyl ester

圖3 尿包后多不飽和脂肪酸甲酯氣相色譜圖Fig.3 Gas chromatogram of Polyunsaturated fatty acid methyl ester

圖4 過柱后EPA純度為98.2%氣相色譜圖Fig.4 After through the column the purity of EPA methyl ester is 98.2%

用氣質(zhì)聯(lián)用色譜儀，對所得到的3種脂肪酸甲酯進行成分和含量分析，如表1所示。粗脂甲酯中含有9種脂肪酸甲酯，其中十六烷酸的含量最高，其次是十六烷烯酸。經(jīng)過尿素包合處理后，多不飽和脂肪酸的含量增多，不飽和脂肪酸的含量降低，其中EPA甲酯的含量達到30.20%。

表1 各步中脂肪酸組成及相對含量(%)Table 1 Composition and relative content of fatty acid on each step experiment(%)

2.2 抗菌實驗結(jié)果

從圖5可以看出，3種脂肪酸甲酯對大腸桿菌和綠膿桿菌沒有明顯的抑菌圈，對枯草桿菌和金黃色葡萄球菌有明顯的抑菌圈。粗脂甲酯的抑菌效果要弱于PUFA甲酯和EPA甲酯的抑菌效果。這與文獻［11］報道的海藻提取物對革蘭氏陽性菌的抑菌效果要強于革蘭氏陰性菌相似。

圖5 3種脂肪酸甲酯分別對大腸桿菌、綠膿桿菌、枯草桿菌、金黃色葡萄球菌的抑菌效果Fig.5 Effect of three fatty acid methyl esters on viability of Escherichia coli，Pseudomonas aeruginos，Bacillus subtilis and Staphylococcus aureus

由表2可以看出，粗脂甲酯和PUFA甲酯對枯草桿菌的抑菌效果最好，MIC值分別為3.594mg/mL和0.831mg/mL。EPA甲酯對金黃色葡萄球菌的抑菌效果最好，MIC為0.692mg/mL。

3 結(jié)論

3.1 海水小球藻是一種天然保健食品，經(jīng)研究測定，其含有蛋白質(zhì)50%，脂肪酸15%～20%。EPA是一種人體內(nèi)不能合成的必需脂肪酸，在人體中具有重要的生物學意義。文中采用了GC-MS技術(shù)對小球藻中脂肪酸的種類和含量進行了測定，并通過提取分離純化得到EPA甲酯的純度為98.20%。為其工業(yè)化生產(chǎn)提供了一定的實驗依據(jù)。

表2 脂肪酸甲酯的抑菌實驗結(jié)果(mg/mL)Table 2 Antibacterial activity of fatty acid methyl esters(mg/mL)

3.2 定性和定量的抗菌實驗表明，脂肪酸甲酯成分對金黃色葡萄球菌和枯草桿菌具有一定的抑制和殺滅作用，且對革蘭氏陽性菌的效果要好于革蘭氏陰性菌。脂肪酸甲酯成分中EPA甲酯的抑菌效果要好于粗脂甲酯和PUFA甲酯，這說明純度越高的EPA甲酯抑菌效果越好。因此，今后可以選用與EPA甲酯相似的其他多不飽和脂肪酸甲酯進行抗菌研究。

［1］李冰，徐濤，蔡敬民.海洋微生物活性物質(zhì)的研究進展［J］.安徽農(nóng)業(yè)科學，2011，39(23):13934-13978.

［2］胡蓓娟，王雪青，姚領(lǐng)，等.從微藻中分離提取生物活性物質(zhì)［J］.食品科學，2006，27(7):264-269.

［3］Naviner M，Berge J P，Du Rand P，et al.Antibacterial activity of the marine diatom Skeleonema costatum against aquacultural pathogens［J］.Aquaculture，1999，174:15-24.

［4］葉錦林，王明茲.紫球藻及其多糖抗菌性能初探［J］.亞熱帶植物科學，2004，33(3):31-33.

［5］Desbois A P，Mearns-Spragg A，Smith V J.A fatty acid from the diatom phaeodactylum tricornutum is antibacterial against diverse bacteria including multi-resistantStaphylococcus aureus(MRSA)［J］.Mar Biotechnol，2009(11):45-52.

［6］Huang C B，George B，Ebersole J L.Antimicrobial activity of n-6，n-7 and n-9 fatty acids and their esters for oral microorganisms［J］.Arghives of oral biology，2010(55):555-560.

［7］Shin SY，Bajpai V K，Kim H R，et al.Antibacterial activity of eicosapentaenoic acid(EPA)against foodborne and food spoilage microorganisms［J］.LWT，2007(40):1515-1519.

［8］王嵩.海藻油中分離純化多烯脂肪酸的研究［D］.天津:天津大學，2008.

［9］江紅霞，鄭怡.8種微藻抗菌活性研究［J］.福建師范大學學報:自然科學版，2002，18(2):117-120.

［10］王文風，梅英杰，徐玲，等.10-HDA抗菌實驗的初步研究［J］.食品研究與開發(fā)，2007，28(10):36-38.

［11］陳灼華，鄭怡，莊惠如.10種紅藻和褐藻抗細菌抗真菌活性的研究［J］.福建師范大學學報:自然科學版，1994，10(4):75-79.