李小多，李學(xué)剛，張 波，宋尚華，劉旭晶，葉小利，*

(1.西南大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，重慶400715;2.西南大學(xué)藥學(xué)院，重慶400716)

血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(angiotensin converting enzyme，ACE)在腎素-血管緊張素系統(tǒng)中具有調(diào)控血壓的重要作用［1］，主要催化血管緊張素Ⅰ轉(zhuǎn)化為具有較強(qiáng)升壓作用的血管緊張素Ⅱ［2］。目前市場上降壓效果較好的卡托普利(caporal)，依那普利(enalapril)等［3］大多是合成藥物，長期服用都會(huì)有不同程度的副作用，如咳嗽、心血管疾病、皮疹、血管性水腫等［4］。我國中藥資源豐富，且有悠久的用藥歷史，篩選對ACE具有強(qiáng)抑制活性的中藥對降壓藥物的開發(fā)具有重要的意義。本實(shí)驗(yàn)采用體外模型［5］，以馬尿酰-組氨酰-亮氨酸(Hip-His-Leu，HHL)為ACE反應(yīng)底物，產(chǎn)物馬尿酸(HIP)為測定指標(biāo)，HIP的生成量與ACE的活性正相關(guān)。以ACE為靶點(diǎn)，用高效液相色譜法(HPLC)［6］測定了32味中藥提取物和活性部位對ACE的抑制作用，篩選出了枸杞以及枸杞提取物的降壓活性部位，并對枸杞活性部位進(jìn)行純化。目前對枸杞以ACE為靶點(diǎn)研究其降血壓功能尚未見報(bào)道，因此，本研究結(jié)果為枸杞降血壓的研究及相關(guān)藥品開發(fā)奠定了一定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

兔肺 中國人民解放軍第三軍醫(yī)大學(xué);葉黃素、山茱萸、丹皮、天花粉、首烏、黃芩、白芍、沙參、木香、菟絲子、桑葉、女貞子、茯苓、玄參、山藥、熟地黃、玉竹、天門冬、太子參、桔梗、麥冬、菊花、淫羊藿、人參、澤瀉、決明子、知母、山楂、五味子、黃芪、佛手、枸杞

購于重慶市安康大藥店;HIP、HHL Sigma公司;東莨菪苷 上海源葉生物科技有限公司;甲醇為色譜純 天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司;其他試劑均為分析級。

LC-20AD型高效液相色譜儀 日本島津;RRH-250型萬能高速粉碎機(jī) 歐凱萊芙寶業(yè)公司;KQ5200DA型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司;RE-52AA旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器 上海亞榮生化儀器廠;pH5-3C+型酸度計(jì) 四川成都方舟科技有限公司;Avanti J-30i高速冷凍離心機(jī) 美國Beckman;HHW-21CU-600恒溫水浴鍋 上海?，攲?shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;TG16-W微量高速離心機(jī) 長沙湘儀離心機(jī)儀器有限公司。

1.2 色譜條件

色譜柱:ODS-BP(4.6mm ×200mm，5μm)，流動(dòng)相為甲醇-0.1%三氟乙酸水溶液(25∶75，v/v);檢測波長 228nm，流速 1.0mL/min，柱溫 37℃，進(jìn)樣量 20μL［2］。

1.3 ACE粗酶的制備

根據(jù)文獻(xiàn)［7-8］方法，加以改進(jìn)，所有操作均在冰水混合物中進(jìn)行。兔肺用0.9%NaCl漂洗至洗液無血紅色，剪至碎塊，4℃冷藏過夜，兔肺與硼酸鹽緩沖液(SSB，0.1mol/L，p H8.3)固液比(g∶mL)1∶5 混合，轉(zhuǎn)入組織勻漿機(jī)中，間歇?jiǎng)驖{(每勻漿20s放入冰箱冷凍30s，反復(fù)3次)，4℃冷藏6h使浸提物充分溶出。在4℃、700×g離心20min，棄沉淀，上清液在4℃、37000×g離心1h，上清液即為ACE粗酶，-20℃儲(chǔ)存?zhèn)溆谩?/p>

1.4 ACE的活性檢測

根據(jù)文獻(xiàn)［9］的方法，適當(dāng)改進(jìn)，設(shè)計(jì)ACE粗酶體積分別為 10、20、40、60、80μL，加入 SSB、HHL 和ACE 總體積 200μL，37℃ 孵化 40min，加入 300μL 1mol/L HCl溶液終止反應(yīng)，10000r/min離心10min，HPLC檢測HIP峰面積。

1.5 中藥提取物的制備

中藥材粉碎，過100目篩，稱取各藥材2.0g，加入體積分?jǐn)?shù)為75%的乙醇提取，料液比(g∶mL)1∶10，常溫超聲(100W，20kHz)提取30min，即為中藥提取物，濃度為0.1g/mL，4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.6 枸杞活性部位的分離及成分的鑒別

1.6.1 枸杞大孔樹脂活性部位的制備 枸杞60℃烘干至恒重，粉碎后過100目篩，石油醚脫脂、脫色素1h［10-11］，體積分?jǐn)?shù)為 75% 的乙醇，料液比(g∶mL)1∶16，75℃回流提取 2h，殘?jiān)貜?fù)提取 1次，合并提取液，75℃濃縮至恒重。浸膏過D-101大孔樹脂，用水、不同體積分?jǐn)?shù)的乙醇(25%、50%、75%、95%)梯度洗脫，洗脫液分別濃縮烘干成浸膏待用。

1.6.2 枸杞硅膠活性部位的制備 將枸杞大孔樹脂抑制率最高的部位60℃烘至恒重，與硅膠(100～200目)質(zhì)量比1∶1拌樣烘干，按質(zhì)量比1∶50裝柱，然后用不同體積比的乙酸乙酯/甲醇作為洗脫劑梯度(9∶1、8∶2、7∶3、6∶4、5∶5，純甲醇和 0.2% 醋酸甲醇)洗脫得 A、B、C、D、E、F、G 七個(gè)部位。分別濃縮烘干成浸膏待用。

1.6.3 ACE抑制成分的分離及鑒別 將枸杞硅膠抑制率最高的部位60℃烘至恒重，用硅膠(200～300目)柱進(jìn)一步分離純化，得到兩個(gè)化合物，以薄層色譜(TLC)進(jìn)行定性分析，經(jīng)核磁(1H-NMR，13C-NMR)鑒定，最終推測枸杞中抑制ACE的主要活性成分。

1.7 供試品溶液的制備

加樣量及順序如表1，37℃溫浴5min后，加入20μL的ACE粗酶啟動(dòng)反應(yīng)，37℃孵化40min，加入300μL 1mol/L HCl溶液終止反應(yīng)，反應(yīng)總體積為500μL，10000r/min離心10min，HPLC 檢測 HIP 峰面積(S)。藥物抑制率按下式計(jì)算:

抑制率 I(%)=(S對照-S藥物)/(S對照-S空白)×100 ACE抑制劑活性用 IC50值表示。IC50為抑制劑對ACE抑制率達(dá)到50%時(shí)抑制劑的量。

表1 ACE反應(yīng)體系(μL)Table 1 ACE reaction system(μL)

2 結(jié)果與討論

2.1 ACE的活性檢測

由圖1可以看出，酶蛋白的體積和HIP峰面積之間有良好的線性關(guān)系，說明此法可以精確檢測ACE的活性，能夠反映酶與底物的反應(yīng)程度，從而確定酶的合適劑量。

圖1 HIP峰面積與ACE體積變化的關(guān)系曲線Fig.1 Relation curve of HIP peak area with ACE volume

2.2 不同中藥提取物對ACE的抑制作用

本實(shí)驗(yàn)將中藥提取物分別配成10、20、40mg/mL 3個(gè)濃度，且3個(gè)濃度的實(shí)驗(yàn)結(jié)果呈很好的線性關(guān)系，表2是20mg/mL藥物濃度的實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)。由表2可知，32味藥材中，葉黃素、山茱萸、丹皮、天花粉、首烏、黃芩、白芍、沙參、木香、菟絲子對ACE沒有抑制作用;其他藥物對ACE都有一定的抑制作用，澤瀉、決明子、知母、山楂、五味子、黃芪、佛手、枸杞對ACE的抑制率都高于60%，其中枸杞的抑制率最高，達(dá)到92.30%，說明枸杞中含有能有效抑制ACE的活性成分。因此，選取枸杞進(jìn)行下一步的研究。HIP標(biāo)準(zhǔn)品、陰性對照及枸杞提取物反應(yīng)液HPLC圖見圖2。由圖2(B)可知，陽性對照體系(SSB+HHL+ACE)反映了ACE具有很高的活性;由圖2(C)可知，枸杞反應(yīng)液體(SSB+HHL+ACE+枸杞提取物)當(dāng)加入抑制劑時(shí)，HIP生成量明顯減少，ACE活性受到抑制。

表2 藥物對ACE的抑制率(%)Table 2 ACE inhibitor rate of traditional Chinese medicines(%)

圖2 HIP對照品(A)、陰性對照(B)、枸杞提取物反應(yīng)液(C)的HPLC圖Fig.2 HPLCchromatograms of HIPreference substances(A)，negative sample(B)，and reaction liquid of Lycium barbarum L.extracts(C)

2.3 枸杞的大孔樹脂活性部位對ACE的抑制率

枸杞提取物總浸膏以及總浸膏經(jīng)D-101大孔樹脂后得到未吸附、水洗脫及25%、50%、75%、95%乙醇洗脫的6個(gè)活性部位，濃縮蒸干，配成濃度為0.1mg/mL的溶液。經(jīng)HPLC法分別檢測各部位對ACE活性的抑制作用，各部位對ACE活性的抑制率如表3，由表3可知，水洗脫部位、95%的乙醇洗脫部位對ACE的抑制作用較小?？偨?、未被大孔樹脂吸附的部位、25%、50%、75%乙醇洗脫部位對ACE活性均有抑制作用，其中50%乙醇部位的抑制率最高，抑制率為35.46%。因此，選取50%乙醇部位進(jìn)一步純化。

表3 大孔樹脂活性部位對ACE的抑制率Table 3 ACE inhibitor rate of eluted fractions from D-101 macroporous adsorption resins

2.4 枸杞的硅膠活性部位對ACE的抑制率

枸杞大孔樹脂的50%洗脫部位經(jīng)硅膠柱吸附，根據(jù)1.6.2得到的 A、B、C、D、E、F和 G 7個(gè)活性部位，濃縮蒸干，配成濃度為0.1mg/mL的溶液。經(jīng)HPLC分別檢測各部位對ACE活性的抑制作用，各部位對ACE的抑制率如表4。由表4可知，G洗脫部位對ACE無抑制作用;其它的活性部位對ACE活性均有抑制作用，其中D洗脫部位的抑制率最高，達(dá)到56.26%。

表4 枸杞活性部位對ACE的抑制率Table 4 ACE inhibitor rate of eluted fractions from silica gel

2.5 枸杞的活性成分對ACE的抑制率及鑒別

將枸杞硅膠洗脫的D部位用硅膠進(jìn)一步分離純化，并對得到的化合物1和2進(jìn)行ACE活性測定，由表5可見，化合物1的抑制率為96.67%，而化合物2的抑制率為26.56%，所以可以初步斷定枸杞中抑制ACE活性物質(zhì)是化合物1?；衔?的核磁波譜數(shù)據(jù)為:紫外燈(365nm)下顯強(qiáng)藍(lán)色熒光。1H-NMR(500Hz，CD3OD)δ:7.89(1H，d，J=9.5Hz，H-4)，7.34(1H，s，H-5)，7.20(1H，s，H-8)，6.29(1H，d，J=9.5Hz，H-3)，3.90(1H，s，OCH3)，5.11(2H，d，J=3.5Hz)，3.18～3.69(多重峰);13C-NMR(500Hz，CDCl3)δ:163.8(C-2)，114.6(C-3)，144.7(C-4)，110.7(C-5)，148.1(C-6)，151.7(C-7，C-8a)，103.6(C-8)，113.1(C-4a)，57.1(OCH3)，60～80 之間碳的個(gè)數(shù)和其化學(xué)位移顯示包含單糖信號［12-13］，特征峰與東莨菪苷對照品基本一致［14］，從其波譜數(shù)據(jù)可以確定化合物1是一種東莨菪糖苷類物質(zhì)?；衔?核磁波譜數(shù)據(jù)為:紫外燈(365nm)下顯強(qiáng)藍(lán)色熒光，黃色針狀結(jié)晶(CHCl3)。1H-NMR(500Hz，CDCl3)δ:7.59(1H，d，J=9.5Hz，H-4)，6.92(1H，s，H-5)，6.85(1H，s，H-8)，6.26(1H，d，J=9.5Hz，H-3)，3.96(1H，s，OCH3);13C-NMR(500Hz，CDCl3)δ:113.5(C-3)，143.2(C-4)，107.2(C-5)，149.8(C-6)，150.2(C-7，C-8a)，103.2(C-8)，111.5(C-4a)，56.3(OCH3)。通過與文獻(xiàn)［15-16］對照，將化合物2鑒定為莨菪亭(scopoletin)，化合物1和2為同系物。推測枸杞中抑制ACE活性的主要成分可能是香豆素類化合物中的一種東莨菪糖苷類物質(zhì)。

3 結(jié)論

表5 化合物對ACE的抑制率Table 5 ACE inhibitor rate of compound

3.1 血管緊張素轉(zhuǎn)化酶(ACE)的活性與血壓的高低直接正相關(guān)，有效的抑制ACE的活性，就能在高血壓的治療中取得顯著的效果。因此，篩選能有效抑制ACE活性的中藥具有重要意義。本實(shí)驗(yàn)用HPLC測定了32味中藥對ACE活性的抑制情況，結(jié)果表明，澤瀉、決明子、知母、山楂、五味子、黃芪、佛手、枸杞對ACE均有一定抑制，其中枸杞的效果最好，為進(jìn)一步研究和開發(fā)枸杞作為降血壓藥物奠定了基礎(chǔ)。對ACE無抑制作用的藥物可能是其降壓機(jī)制不是以ACE為靶點(diǎn)，而是通過其他途徑使血壓降低，或者這些藥物本身無降壓作用，這個(gè)問題有待進(jìn)一步研究。

3.2 目前對枸杞以ACE為靶點(diǎn)研究其降血壓功能的研究尚未見報(bào)道。本實(shí)驗(yàn)通過對枸杞乙醇提取液進(jìn)行大孔樹脂吸附，以乙醇梯度洗脫，經(jīng)HPLC測定了枸杞各部位對ACE的抑制作用。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，50%的乙醇洗脫液對ACE有最強(qiáng)抑制作用。乙醇體積分?jǐn)?shù)過低有效成分未能充分解吸附，而乙醇體積分?jǐn)?shù)過高會(huì)把色素等雜質(zhì)沖洗下來，從而影響有效成分的富集，所以50%的乙醇對于抑制ACE酶的有效成分的解吸附最適宜。對50%的乙醇部位用硅膠進(jìn)一步純化，結(jié)果發(fā)現(xiàn)D洗脫部位對ACE的抑制率達(dá)到56.26%，說明硅膠能有效的純化枸杞中對ACE有抑制效果的活性物質(zhì)。通過對D洗脫部位進(jìn)一步的分離純化，結(jié)果得到兩個(gè)化合物，東莨菪糖苷類化合物的抑制率為96.67%，莨菪亭的抑制率為26.56%，通過核磁鑒定，推測枸杞中抑制ACE活性的主要物質(zhì)可能為香豆素類化合物中的一種東莨菪糖苷類物質(zhì)。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果豐富了枸杞的藥用價(jià)值，開辟了枸杞降血壓的新途徑;但抑制ACE活性的具體成分、化學(xué)結(jié)構(gòu)和作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。

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