劉 野，鄒婷婷，宋煥祿

(北京工商大學(xué)食品風(fēng)味化學(xué)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/食品添加劑與配料北京高校工程研究中心，北京100048)

西瓜是一種季節(jié)性很強(qiáng)并且產(chǎn)量很大的水果。據(jù)聯(lián)合國糧農(nóng)組織統(tǒng)計(jì)，2007年全世界西瓜產(chǎn)量約為9300萬t，中國的產(chǎn)量約為6300萬t，約占全世界2/3［1］。西瓜的主要消費(fèi)方式是鮮食，其中很小一部分用來加工。我國西瓜的加工主要是針對果肉，產(chǎn)品有西瓜汁、鮮切西瓜和西瓜霜等［2］。而對于西瓜的副產(chǎn)品(包括西瓜皮和西瓜籽)綜合利用卻較少。西瓜籽在西瓜中所占比例雖然較低，但由于西瓜產(chǎn)量巨大，仍然是一種極具開發(fā)潛力的資源。西瓜籽中含有豐富的蛋白質(zhì)和油脂，其含量分別為30%和50%左右［3-6］。在西瓜籽蛋白質(zhì)中，精氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、亮氨酸是幾種含量較高的氨基酸［5］。其中亮氨酸是人體必需氨基酸，精氨酸是人體半必需氨基酸，因此西瓜籽蛋白質(zhì)具有較高的營養(yǎng)價(jià)值［7-8］。本研究擬采用堿溶液等電點(diǎn)沉淀法對西瓜籽蛋白質(zhì)進(jìn)行提取，通過單因素實(shí)驗(yàn)考察NaOH濃度、提取溫度、提取時(shí)間和液料比四個(gè)因素對提取率的影響，并采用響應(yīng)曲面法對西瓜籽蛋白質(zhì)提取條件進(jìn)行優(yōu)化，以期為工業(yè)化生產(chǎn)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

西瓜(小鳳) 北京美廉美超市增光路店;氯化鈉 分析純，北京化學(xué)試劑二廠;牛血清白蛋白 美國Sigma公司;氫氧化鈉、硫酸、磷酸、正己烷、乙醇分析純，北京化工廠;考馬斯亮藍(lán)R-250 國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司。

JYL-C012九陽料理機(jī) 九陽股份有限公司;JA5003電子天平 上海精密科學(xué)儀器有限公司;HJ-3數(shù)顯恒溫磁力攪拌器 常州國華電器有限公司;Q/CGT001-2000恒溫水浴鍋 山東鄄城華魯電熱儀器有限公司;DHG-9246A電熱恒溫鼓風(fēng)干燥箱 上海精密實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司;CR22G高速冷凍離心機(jī) 日本日立公司;22PC可見分光光度計(jì) 上海校光技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 西瓜籽脫脂 將晾干的西瓜籽用料理機(jī)磨碎，稱重。按照1∶10(W/V)的料液比，加入正己烷，常溫下用磁力攪拌器攪拌15min。去除液體部分，將固體部分在45℃的恒溫干燥箱內(nèi)干燥6h后取出，置于冰箱冷藏室中保存待用。

1.2.2 西瓜籽蛋白的提取 稱取2g脫脂西瓜籽，放入250mL燒杯中，加入一定體積、不同濃度的NaOH溶液。將燒杯置于預(yù)先設(shè)定好溫度的恒溫水浴內(nèi)進(jìn)行蛋白質(zhì)提取，提取過程要不斷攪拌。達(dá)到提取時(shí)間后，將上述混合溶液在10000r/min，4℃下離心15min。上清液即為西瓜籽蛋白粗提液。

1.2.3 西瓜籽蛋白濃度測定 西瓜籽蛋白質(zhì)含量采用 Bradford 法進(jìn)行測定［9］。

蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作:準(zhǔn)確吸取0.1mg/mL標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液 0.1、0.2、0.3、0.4、0.6、0.8mL，用 0.9%NaCl溶液和4mL考馬斯亮藍(lán)染液補(bǔ)足到5mL。在595nm波長下測定溶液吸光值，以標(biāo)準(zhǔn)蛋白溶液濃度為橫坐標(biāo)，吸光值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得到蛋白質(zhì)標(biāo)準(zhǔn)曲線的回歸方程為:y=0.0128x-0.0021，R2=0.9967。

西瓜籽蛋白濃度的測定:取1mL稀釋20000倍的西瓜籽蛋白粗提液與4mL考馬斯亮藍(lán)染液混合，室溫下靜置3min，在595nm波長下測定吸光值，通過標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算蛋白濃度。

1.2.4 西瓜籽蛋白提取率的計(jì)算 根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線求出相當(dāng)于樣品吸光度的蛋白含量，按下式求出西瓜籽中蛋白提取率。

其中:Y為西瓜籽蛋白的提取率(%);m1為粗提液中蛋白濃度(μg);m為脫脂西瓜籽的干重(mg);V1為測定用粗提液的體積(mL);V2為提取液的總體積(mL)。

1.2.5 單因素實(shí)驗(yàn)

1.2.5.1 提取溫度的影響 固定NaOH濃度為0.9%，提取時(shí)間為15min，液料比為50∶1，提取溫度設(shè)定 40、45、50、55、60℃五個(gè)水平梯度，考察提取溫度對西瓜籽蛋白提取率的影響。每個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)做三次重復(fù)。

1.2.5.2 NaOH濃度的影響 固定提取溫度為50℃，提取時(shí)間為15min，液料比為50∶1，NaOH濃度設(shè)定0.3%、0.6%、0.9%、1.2%、1.5%五個(gè)水平梯度，考察NaOH濃度對西瓜籽蛋白提取率的影響。每個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)做三次重復(fù)。

1.2.5.3 提取時(shí)間的影響 固定提取溫度為50℃，NaOH濃度為0.9%，液料比為50∶1，提取時(shí)間設(shè)定5、10、15、20、25min 五個(gè)水平梯度，考察提取時(shí)間對西瓜籽蛋白提取率的影響。每個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)做三次重復(fù)。

1.2.5.4 液料比的影響 固定提取溫度為50℃，NaOH濃度為0.9%，提取時(shí)間為15min，液料比設(shè)定30∶1、40∶1、50∶1、60∶1、70∶1 五個(gè)水平梯度，考察液料比對西瓜籽蛋白提取率的影響。每個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)做三次重復(fù)。

1.2.6 響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn) 應(yīng)用Design Expert 8.05軟件，根據(jù)Box-Behnken中心組合設(shè)計(jì)原理，以蛋白提取率為響應(yīng)值，在單因素實(shí)驗(yàn)結(jié)果的基礎(chǔ)上，綜合考慮實(shí)際生產(chǎn)的需要，對提取溫度、NaOH濃度、提取時(shí)間和液料比四個(gè)因素進(jìn)行響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，因素水平見表1。每個(gè)實(shí)驗(yàn)點(diǎn)做三次重復(fù)。

表1 響應(yīng)曲面實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)因素水平表Table 1 Factors and levels of response surface experiments

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實(shí)驗(yàn)

2.1.1 提取溫度的影響 由圖1可以看出，其他條件(NaOH濃度為0.9%，提取時(shí)間為15min，液料比為50∶1)固定時(shí)，西瓜籽蛋白質(zhì)的濃度隨著溫度的升高而增加。在溫度為50℃時(shí)提取率最高(p＜0.05);而后隨著溫度升高西瓜籽蛋白質(zhì)提取率逐漸降低。適當(dāng)提高溫度使蛋白質(zhì)分子熱動(dòng)能增加而導(dǎo)致蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的展開，使原先埋藏在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)內(nèi)部的非極性基團(tuán)暴露，促進(jìn)了集聚和沉淀作用，使提取率提高;但溫度過高會(huì)引起蛋白質(zhì)變性，導(dǎo)致提取率降低［10-11］。因此，本實(shí)驗(yàn)確定的最佳提取溫度為50℃。

圖1 提取溫度對西瓜籽蛋白提取率的影響Fig.1 Effect of temperature on the extraction of watermelon seed protein

2.1.2 NaOH濃度的影響 由圖2可以看出，當(dāng)其他條件(提取溫度為50℃，提取時(shí)間為15min，液料比為50∶1)固定時(shí)，西瓜籽蛋白質(zhì)的濃度隨著NaOH濃度的增大呈先增大后減小的趨勢。在NaOH濃度為1.2%時(shí)，西瓜籽蛋白質(zhì)的提取率最高(p＜0.05);在超過1.2%后，蛋白質(zhì)的提取率會(huì)降低。由于堿液對蛋白質(zhì)體系的平衡有影響，堿液的濃度在一定范圍內(nèi)可以加快蛋白質(zhì)的溶解并提高提取率;而堿液濃度過高會(huì)導(dǎo)致蛋白質(zhì)多肽鏈中某些側(cè)鏈基團(tuán)的解離程度發(fā)生變化，破壞了蛋白質(zhì)分子空間構(gòu)象，使蛋白質(zhì)變性，提取率降低［12］。因此，本實(shí)驗(yàn)確定的NaOH最佳濃度為1.2%。

2.1.3 提取時(shí)間的影響 由圖3可以看出，當(dāng)其他條件(NaOH濃度為0.9%，提取溫度為50℃，液料比為50∶1)固定時(shí)，西瓜籽蛋白質(zhì)的濃度隨著提取時(shí)間的延長呈現(xiàn)先增大后減小的趨勢。這是由于隨著提取時(shí)間的延長，溶液中的蛋白質(zhì)出現(xiàn)凝聚沉淀，離心時(shí)蛋白質(zhì)和殘?jiān)煌慌懦?，從而降低了蛋白質(zhì)的提取率［13-14］。在提取時(shí)間為10min時(shí)，西瓜籽蛋白質(zhì)的提取率最高(p＜0.05)。因此，本實(shí)驗(yàn)確定的最佳提取時(shí)間為10min。

圖2 NaOH濃度對西瓜籽蛋白提取率的影響Fig.2 Effect of NaOH concentration on the extraction of watermelon seed protein

圖3 提取時(shí)間對西瓜籽蛋白提取率的影響Fig.3 Effect of time on the extraction ofwatermelon seed protein

2.1.4 液料比的影響 由圖4可以看出，其他條件(NaOH濃度為0.9%，提取時(shí)間為15m in，提取溫度為50℃)固定時(shí)，西瓜籽蛋白質(zhì)的濃度隨著液料比的升高而增大，在液料比為40∶1時(shí)提取率最高(p＜0.05);隨著液料比的增加，西瓜籽蛋白質(zhì)提取率降低。因此，本實(shí)驗(yàn)確定的最佳液料比為40∶1。

圖4 液料比對西瓜籽蛋白提取率的影響Fig.4 Effect of liquid/solid ratio on the extraction of watermelon seed protein

2.2 響應(yīng)曲面分析

以提取溫度、NaOH濃度、提取時(shí)間和液料比為四個(gè)可控工藝參數(shù)，以提取率為實(shí)驗(yàn)指標(biāo)，采用Box-Behnken設(shè)計(jì)方法來優(yōu)化西瓜籽蛋白提取工藝條件，實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)方案及結(jié)果見表2。

利用Design Expert軟件，通過表3中實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元回歸擬合，獲得西瓜籽蛋白質(zhì)提取率對編碼自變量提取溫度、提取時(shí)間、NaOH濃度、液料比的二次多項(xiàng)回歸方程:

表2 Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果Table 2 Box-Behnken experimental design and results

表3 回歸模型方差分析Table 3 Analysis results of regression and variance

由表3可以看出，本實(shí)驗(yàn)所選用的二次多項(xiàng)模型具有高度的顯著性(pmodel＜0.0001)，其 R2為0.9150，這表明西瓜籽蛋白質(zhì)的提取率有91.50%來源于所選變量，即提取溫度、NaOH濃度、提取時(shí)間和液料比。因此，此模型擬合情況較好，可用該回歸方程代替實(shí)驗(yàn)真實(shí)點(diǎn)對實(shí)驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行分析。回歸方程的各項(xiàng)方差分析結(jié)果表明，一次項(xiàng)和二次項(xiàng)都有顯著性因素，因此各實(shí)驗(yàn)因素對西瓜籽蛋白質(zhì)提取率的影響不是簡單的線性關(guān)系。所以，可以利用該回歸方程確定最佳工藝條件。

由回歸方程可知，提取溫度和NaOH濃度對西瓜籽蛋白質(zhì)提取率有負(fù)效應(yīng)，提取時(shí)間和液料比對其有正效應(yīng)。一次項(xiàng)中，A、C對結(jié)果的影響均顯著(p＜0.05);B對結(jié)果影響極顯著(p＜0.01);D對結(jié)果影響不顯著(p＞0.05)。回歸模型中顯示了多項(xiàng)交互作用，其中除BC作用極顯著外(p＜0.01)，其它交互作用均顯著(p＜ 0.05)。二次項(xiàng)中，A2、B2、C2、D2均對結(jié)果影響極顯著(p＜0.01)。因此，在一定范圍內(nèi)可調(diào)節(jié)提取溫度、NaOH濃度、提取時(shí)間和液料比，使西瓜籽蛋白質(zhì)的提取率達(dá)到所需水平。

F值可以反映各因素對西瓜籽蛋白提取率的重要性，F(xiàn)值越大表明對提取率的影響越大，即重要性越大。表3中，F(xiàn)A=2.19;FB=7.96;FC=1.43;FD=0.42，即各因素對提取率影響程度的大小順序?yàn)?NaOH濃度＞提取溫度＞提取時(shí)間＞液料比。通過Design-Expert軟件分析，模擬得出提取率最高的優(yōu)化組合為 A=49.14℃、B=1.14%、C=9.99min、D=40.34∶1，西瓜籽蛋白質(zhì)提取率最高值為68.64%。

在回歸模型方差分析結(jié)果的基礎(chǔ)上，根據(jù)得到的回歸二次方程，利用Design Expert 8.05軟件作提取溫度、NaOH濃度、提取時(shí)間和液料比對提取率影響的響應(yīng)曲面圖，分析兩個(gè)因素交互作用對西瓜籽蛋白提取率的影響。從圖5(a～f)看出，在每組交互作用的作用下，西瓜籽蛋白質(zhì)提取率均有最大值，因此說明各組交互作用均對西瓜籽蛋白質(zhì)提取率有影響。但各圖中兩因素對西瓜籽蛋白質(zhì)提取率影響的大小只能通過方差分析得出，而不能僅依靠等高線的疏密度判斷。

通過軟件分析，得到西瓜籽蛋白提取的最佳工藝條件為溫度為49.14℃、NaOH濃度為1.14%、提取時(shí)間9.99min、液料比為40.34∶1，該條件下西瓜籽蛋白提取率預(yù)測值為68.64%。采取上述最優(yōu)條件進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，同時(shí)考慮到實(shí)際操作的情況，將西瓜籽蛋白質(zhì)提取條件修正為提取溫度50℃、NaOH濃度1.2%、提取時(shí)間 10min、液料比 40∶1，實(shí)測提取率為68.48%。該值與理論最大值接近，說明采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化西瓜籽蛋白提取工藝可行。

Wani等人采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化研究得出當(dāng)NaOH濃度為1.2%、液料比為70∶1、提取溫度為40℃、提取時(shí)間為15min時(shí)，西瓜籽蛋白的提取率達(dá)到最大值86.08%［15］。除液料比存在較大差距外，其他因素的條件與本研究較為一致，而西瓜品種的不同導(dǎo)致提取率的差異。另外，采用響應(yīng)曲面法優(yōu)化得到番茄籽蛋白的最佳提取工藝為:NaOH濃度1.2%、液料比 70∶1、提取溫度 60℃、提取時(shí)間5min［16］。提取條件的差異主要是由不同植物種子的結(jié)構(gòu)、蛋白質(zhì)的種類以及存在狀態(tài)決定。

圖5 各因素交互作用對西瓜籽蛋白提取率影響的響應(yīng)曲面圖Fig.5 Response surface plots showing the interactive effects of various extraction conditions on the extraction yield of watermelon seed protein

3 結(jié)論

通過單因素實(shí)驗(yàn)和Box-Behnken實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)以及響應(yīng)面分析對西瓜籽蛋白提取工藝進(jìn)行了優(yōu)化，各因素對提取率的影響大小為:NaOH濃度＞提取溫度＞提取時(shí)間＞液料比。結(jié)合實(shí)際操作，確定提取西瓜籽蛋白質(zhì)的最優(yōu)條件是:提取溫度50℃、NaOH濃度1.2%、提取時(shí)間10min、液料比40∶1，西瓜籽蛋白質(zhì)提取率最高值為68.48%。

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