陳邦元，徐金娣，丁 妍，朱玲英，李松林

西洋參為五加科植物西洋參(Panax quinquefolium L)的干燥根，能補氣養(yǎng)陰，清熱生津［1］。人參為五加科植物人參(Panax ginseng C.A.Mey)的干燥根，能滋補脾益肺、生津止渴、安神益智、調(diào)榮養(yǎng)衛(wèi)、大補元氣、復(fù)脈固脫，是常用的滋補強壯藥［2］。西洋參和人參在中國均有栽培，其須根是西洋參和人參生產(chǎn)過程中的副產(chǎn)品，因皂苷含量高，且價格分別比西洋參和人參低廉，近年來被用來作為開發(fā)保健產(chǎn)品的原料或直接應(yīng)用。但西洋參須根和人參須根在形態(tài)學(xué)上無明顯區(qū)別，文獻亦沒有鑒別方法的報道，因此迫切需要一種快速方法對其予以準(zhǔn)確鑒定。

1 材料與方法

1 材料與方法

1.1 實驗材料

1.1.1 儀器 Waters UPLC H-Claaa/TQD 色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀(美國Waters公司);梅特勒十萬分之一電子天平(瑞士梅特勒公司);KQ-500DE型數(shù)控超聲波清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);Milli-Q純水器(美國Milli-Q公司)。

1.1.2 試劑和藥材 西洋參須根(JSPACM-03-64-1)，2012年 10月采自山東文登;人參須根(JSPACM-03-63-1)，2011年10月采自吉林通化，標(biāo)本存江蘇省中醫(yī)藥研究院中藥分析和代謝組研究室。人參皂苷Rf(Ginsenoside Rf)和24(R)-擬人參皂苷F11(24(R)-pseudoginsenoside F11)分別從人參和西洋參中分離純化制得，結(jié)構(gòu)經(jīng)NMR和MS分析確證，純度經(jīng)高效液相分析大于95%，結(jié)構(gòu)見圖1。乙腈(色譜純，美國，Tedia公司)、甲酸(色譜純，日本，東京化成工業(yè)株式會社)、甲醇(分析純，南京，漢邦科技公司)。

圖1 人參皂苷Rf和24(R)-擬人參皂苷F11結(jié)構(gòu)式

1.2 實驗方法

1.2.1 色譜條件 ACQUITY UPLC BEH C18(2.1 mm × 50 mm，1.7 μm)色譜柱;采用乙腈(B)-0.1%甲酸水溶液(A)為流動相進行梯度洗脫，梯度如下:0～1 min，5% ～15%B;1 ～10 min，15% ～35%B;10～14 min，35% ～42%B;14～24 min，42% ～80%B;24～25 min，80% ～5%B;25 ～27 min，5%B;柱溫40°C;流速 0.5 ml/min;進樣量 4 μl。

1.2.2 質(zhì)譜檢測條件 電噴霧離子源(ESI)，負離子模式，毛細管電壓為2.5 kV，錐孔電壓40 V，離子源溫度為120℃，脫溶劑氣溫度400℃，脫溶劑氣流量600 L/h，錐孔氣流量50 L/h，掃描范圍質(zhì)荷比(m/z)300～2000。子離子掃描，母離子799，碰撞能量30 V，錐孔電壓30 V。

1.2.3 對照品溶液的制備 分別精密稱取人參皂苷Rf(A)和24(R)-擬人參皂苷F11(B)適量，用甲醇配制成濃度為10 μg/ml的對照品標(biāo)準(zhǔn)溶液(Std)A和B，于4℃存放備用。

1.2.4 供試品溶液的制備 將人參須根和西洋參須根粉碎成細粉，精密稱取兩種粉末各5.0 g分置具塞錐形瓶中，加入50 ml 70%甲醇溶液超聲(500 W，40 kHz)處理45 min取出，以半徑8 cm、10 000 rpm，離心10 min，取上清液用0.45 μm微孔濾膜過濾，得濾液，色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)分析。

2 結(jié)果

2.1 對照品溶液的超高效液相分離和質(zhì)譜檢測人參皂苷Rf(tR 7.77 min)和24(R)-擬人參皂苷F11(tR 7.92 min)能達到基線分離，總離子流色譜圖見圖2。

圖2 人參皂苷Rf(tR 7.77 min)和24(R)-擬人參皂苷F11(tR 7.92 min)總離子色譜圖

2.2 對照品溶液的質(zhì)譜全掃描及子離子掃描 分別對人參皂苷Rf和24(R)-擬人參皂苷F11進行質(zhì)譜全掃描并對分子離子峰進行子離子掃描(全掃描質(zhì)譜圖見圖3，二級裂解圖見圖4)。由圖3可見，二者均有m/z 799［M-H］－的分子離子峰和m/z 845［MH+HCOOH］－加合離子峰，但人參皂苷Rf的分子離子峰強度大于加合離子峰(A)，而24(R)-擬人參皂苷F11的分子離子峰強度要比加合離子峰弱(B)。由圖4可見，二者均有m/z 799［M-H］－的分子離子峰，但人參皂苷 Rf具有 m/z 475［M-H-2(Glu-H2O)］－碎片離子峰(圖4A)，24(R)-擬人參皂苷F11具有m/z 653［M-H-(Rha-H2O)］-碎片離子(圖4B)。

圖3A 人參皂苷Rf質(zhì)譜全掃描圖

圖3B 24(R)-擬人參皂苷F11質(zhì)譜全掃描圖

圖4A 人參皂苷Rf子離子掃描圖

圖4B 24(R)-擬人參皂苷F11子離子掃描圖

2.3 樣品鑒定分析 在同樣條件下分別對人參須根樣品和西洋參須根樣品進行分析，總離子流圖、全掃描質(zhì)譜圖和二級質(zhì)譜圖見圖5和圖6。在人參須根樣品中有tR 7.78的峰出現(xiàn)(圖5A)并且具有m/z 799［MH］－的分子離子峰和m/z 845［M-H+HCOOH］－加合離子峰(圖5B)，且前者強度比后者強，子離子掃描中，檢測到m/z 475［M-H-2(Glu-H2O)］－(圖5C);在西洋參須根樣品中有tR 7.90的峰出現(xiàn)(圖6A)，且具有m/z 799［M-H］－的分子離子峰和 m/z 845［M-H+HCOOH］－加合離子峰(圖6B)，前者強度比后者弱，進一步對其進行質(zhì)譜分析發(fā)現(xiàn)了24(R)-擬人參皂苷F11的碎片離子峰653［M-H-(Rha-H2O)］－(圖6C)。

圖5A 人參須根樣品總離子流圖

圖5B 人參須根樣品峰tR7.78min全掃描質(zhì)譜圖

圖5C 人參須根樣品峰tR7.78min子離子掃描質(zhì)譜圖

圖6A 西洋參須根樣品總離子流圖

圖6B 西洋參須根樣品峰全掃描質(zhì)譜圖

圖6C 西洋參須根樣品峰子離子掃描質(zhì)譜圖

3 討論

傳統(tǒng)的藥材鑒別方法有形態(tài)學(xué)鑒別、顯微鑒定等，現(xiàn)代手段有 DNA 條形碼技術(shù)［3-4］、色譜［5］和色譜-質(zhì)譜聯(lián)用手段［6-8］等。由于藥材發(fā)揮藥效的物質(zhì)基礎(chǔ)是其所含有的化學(xué)成分，因此，從保證藥材的有效性和安全性角度看，色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)鑒別是更能體現(xiàn)藥材有效性和安全性的方法。

人參中主要成分是人參皂苷，分為人參二醇型人參皂苷和人參三醇型人參皂苷［9］;而西洋參中也主要含人參皂苷，其中人參皂苷 Rb1、Re、Rd、Rc、Rg1和Rb3是其六個主要皂苷，占總皂苷的70%左右［10］。雖然二者主要成分大部分類似，但有學(xué)者［11-12］對人參和西洋參進行分析研究發(fā)現(xiàn)，人參皂苷Rf只在人參中存在，而24(R)-擬人參皂苷F11只存在于西洋參中，因此這兩種皂苷可作為特征性成分區(qū)分西洋參和人參。也有學(xué)者［13］研究發(fā)現(xiàn)Rg1/Rb1與Rb2/Rb1的比值在西洋參中小于0.4，而在人參中大于0.4。但 Schlag等［14］指出在野生西洋參中，Rg1/Rb1值較高，大于0.4。可見這種鑒別方法存在一定局限性。人參和西洋參可以通過特征成分的存在進行區(qū)別，但人參須根和西洋參須根中是否也同樣分別含有這兩種特征性皂苷成分，能否通過這兩種特征成分區(qū)分人參須根和西洋參須根則未見文獻報道。

本研究通過對人參皂苷Rf和24(R)-擬人參皂苷F11的色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法進行分析，發(fā)現(xiàn)雖然二者均可見m/z 799［M-H］－的分子離子峰和m/z 845［M-H+HCOOH］－加合離子峰，但二者的這兩種離子的離子強度和分子離子峰的二級裂解行為存在差異。對于人參皂苷Rf，其分子離子峰強度要比加合離子峰強，并且在其二級質(zhì)譜中可見m/z 475［MH-2(Glu-H2O)］－的特征碎片離子，而對于24(R)-擬人參皂苷F11，其分子離子峰強度要比加合離子峰弱，并且其二級質(zhì)譜中可見m/z 653［M-H-(Rha-H2O)］－的特征碎片離子。本研究中，在同樣條件下，利用所建立的分子離子峰與加合離子峰強度差異和特征碎片離子鑒別法對人參須根和西洋參須根進行色譜-質(zhì)譜分析，人參須根樣品中出現(xiàn)了人參皂苷Rf的質(zhì)譜特征，而未見24(R)-擬人參皂苷F11的質(zhì)譜特征;在西洋參樣品中出現(xiàn)了24(R)-擬人參皂苷F11的質(zhì)譜特征，而未見人參皂苷Rf的質(zhì)譜特征。

綜上所述，本研究所建立的以24(R)-擬人參皂苷F11和人參皂苷F11為特征成分的色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法具有快速和高選擇性特點，是快速鑒別商品西洋參須根和人參須根的有效分析方法。

［1］ 李 勉，劉廣河，喬改枝.西洋參國產(chǎn)品與進口品的質(zhì)量鑒別［J］.河南大學(xué)學(xué)報，2005，2(4):26-28.

［2］ 曹 智，張燕娣，許永華，等.人參有效成分及其藥理作用研究新進展［J］.人參研究，2012，24(2):39-43.

［3］ Yao H，Song J，Liu C，et al.Use of ITS2 region as the universal DNA barcode for plants and animals［J］.Plo Sone，2010，5(10):e13102.

［4］ Zuo YJ，Chen ZJ，Kondo K，et al.DNA barcoding of panax species［J］.Planta Med，2011，77:182-187.

［5］ 邢旺興，鄭筱祥，馬炬明，等.通光藤苷J的HPLC分析方法及應(yīng)用［J］.東南國防醫(yī)藥，2006，8(1):12-14.

［6］ Li SL，Shen H，Zhu LY，et al.Ultra-high-performance liquid chromatography-quadrupole/time of flight mass spectrometry based chemical profiling approach to rapidly reveal chemical transformation of sulfur-fumigated medicinal herbs，a case study on white ginseng［J］.J Chromatogr A，2012，1231:31-45.

［7］ Zhang HM，Li SL，Zhang H，et al.Holistic quality evaluation of commercial white and red ginseng using a UPLC-QTOF-MS/MS-based metabolomics approach［J］.J Pharm Biomed Anal，2012，62:258-273.

［8］ Li SL，Song JZ，Qiao CF，et al.A novel strategy to rapidly explore potential chemical markers for the discrimination between raw and processed Radix Rehmanniae by UHPLC-TOFMS with multivariate statistical analysis［J］.J Pharm Biomed Anal，2010，51:812-823.

［9］ Qi LW，Wang CZ，Yuan CS.Isolation and analysis of ginseng:Advance and challenges［J］.Nat Prod Rep，2011，28(3):467-495.

［10］ Yuan CS，Wang CZ，Qi LW，et al.Chemical and pharmacological studies of saponins with a focus on American ginseng［J］.J Ginseng Res，2010，34(1):160-167.

［11］ Li WK，Gu CG，Zhang HJ，et al.Use of high-performance liquid chromatography-tandem mass spectrometry to distinguish Panax ginseng C.A.Meyer(Asian Ginseng)and Panax quinquefolius L(North American ginseng)［J］.Anal Chem，2000，72(21):5417-5422.

［12］ Chan TWD，But PPH，Cheng SW，et al.Differentation and authentication of Panax ginseng，Panax quinquefolius，and Ginseng products by using HPLC/MS［J］.Anal Chem，2000，72(6):1281-1287.

［13］ Nakamura S，Sugimoto S，Matsuda H，et al.New dammarane-type triterpene glycosides from flower buds of American ginseng，Panax quinquefolium L［J］.Chem Pharm Bull，2007，55(9):1342-1348.

［14］ Schlag EM，Mcintosh MS.Ginsenoside conten and variation among and within American ginseng(Panax quinquefolius L.)populations［J］.Phytochemistry，2006，67(14):1510-1519.