崔 穎，王月田，姚 梅，胡 晶，李俊霞，王 宇，張 本

(遼寧醫(yī)學院附屬第一醫(yī)院耳鼻咽喉科，遼寧錦州121000)

創(chuàng)傷和疾病引起的頭頸部軟骨缺損的修復(fù)是耳鼻咽喉科頭頸外科醫(yī)師面臨的難題。骨髓間充質(zhì)干細胞(bone marrow mesenchymal stem cells，BMSCs)是源于中胚層的一類多能干細胞，是目前公認的理想的種子細胞。近年來的研究已證明轉(zhuǎn)化生長因子、骨形態(tài)發(fā)生蛋白、生長分化因子等在誘導(dǎo)BMSCs向軟骨細胞分化的過程中發(fā)揮著重要的調(diào)節(jié)作用。但是目前有關(guān)選用何種生長調(diào)節(jié)因子以及如何保證其持續(xù)高效的刺激作用還處于探索階段。軟骨源性形態(tài)發(fā)生蛋白1(cartilage-derived morphogenetic protein 1，CDMP1)是近年來發(fā)現(xiàn)的一種多肽生長因子，具有特異的軟骨誘導(dǎo)能力，可在異位誘導(dǎo)形成軟骨。有關(guān)CDMP1對BMSCs誘導(dǎo)作用的研究多數(shù)是重組細胞因子的直接刺激作用，但細胞因子在體內(nèi)代謝快，持續(xù)時間短，誘導(dǎo)效率低，并且價格昂貴，使其應(yīng)用受到一定的限制。隨著組織工程和基因工程的發(fā)展，細胞治療［1-4］和基因治療成為很有前途的治療方法。因此，通過基因工程技術(shù)將外源CDMP1基因?qū)隑MSCs，使其持續(xù)穩(wěn)定高效表達是解決上述問題的一種措施。本實驗將重組hCDMP1腺病毒感染的BMSCs與PLGA復(fù)合修復(fù)喉軟骨缺損，為基因工程化軟骨提供一種新的思路和方法。

1 材料與方法

1.1 動物

清潔級1月齡新西蘭白兔［遼寧醫(yī)學院動物中心，SYXK(遼)2009-0004］。

1.2 主要試劑

DMEM、胎牛血清、青霉素、鏈霉素、胰蛋白酶、兔抗人CDMP1多克隆抗體及甲苯胺藍(Sigma公司)，病毒液Ad-CMV-hCDMP1-IRES-eGFP和病毒液Ad-CMV-eGFP(廣州賽業(yè)生物科技有限公司)，胃蛋白酶(福州邁新生物科技開發(fā)公司)，聚乳酸-羥基乙酸共聚物(濟南岱罡公司)，Ⅱ型膠原蛋白多克隆抗體(上海優(yōu)寧維生物科技公司)，免疫組化試劑盒(北京博奧森公司)。

1.3 BMSCs的分離和培養(yǎng)

無菌條件下，取1月齡的健康新西蘭白兔股骨骨髓，100目篩網(wǎng)過濾，濾液轉(zhuǎn)入離心管，淋巴細胞分離液進行梯度離心［5］，取單核細胞層，無血清的L-DMEM洗滌細胞兩次，2%錐蟲藍染色，細胞計數(shù)，以4×105/mL的濃度接種于培養(yǎng)瓶中。48 h首次半換液，以后每隔2～3 d換液1次。

1.4 CDMP基因轉(zhuǎn)染BMSCs

取第3代兔BMSCs以5×105/孔的濃度接種于6孔板中常規(guī)培養(yǎng)24 h，待細胞貼壁后吸去上清。按照感染復(fù)數(shù)(MOI)=50、100、200和300四個值轉(zhuǎn)染BMSCs，留下2孔作為陰性對照。37℃孵育3 h，換成完全培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)48～72 h，熒光倒置顯微鏡下檢測eGFP，以不引起明顯細胞病變效應(yīng)(cytopathic effect，CPE)的最大MOI作為腺病毒的最佳MOI值。取第3代生長狀態(tài)良好、生長至約80%匯合的BMSCs，隨機分為3組。轉(zhuǎn)染組:感染 Ad-CMV-hCDMP1-IRES-eGFP(A組);未轉(zhuǎn)染組:感染Ad-CMV-eGFP(B組);對照組:未感染病毒(C組)。各組病毒液以最佳MOI值分別轉(zhuǎn)染BMSCs，48～72 h在熒光倒置顯微鏡下觀察感染效果，計算感染效率。

1.5 RT-PCR檢測基因轉(zhuǎn)染后的CDMP1 mRNA表達

提取細胞總RNA，1%瓊脂糖凝膠電泳檢測，RT-PCR檢測hCDMP1的表達。引物序列(表1)。

表1 引物序列Table 1 Sequence of primer

1.6 免疫印跡法(Western blot)檢測CDMP1蛋白的表達

制備蛋白樣品，測定蛋白含量，據(jù)標準曲線計算出蛋白濃度，上樣，電泳，轉(zhuǎn)膜，凝膠成像系統(tǒng)分析膜上目的條帶與內(nèi)參照。

1.7 免疫組化方法檢測轉(zhuǎn)染后細胞Ⅱ型膠原的表達

取感染后72 h的上述3組細胞爬片(每組10張)，丙酮固定。免疫組化方法檢測細胞Ⅱ型膠原的表達。醫(yī)學圖像分析系統(tǒng)測定染色的吸光度。200倍鏡下切片隨機選取3個陽性視野測量吸光度，取其均值表示該標本的蛋白表達強度。

1.8 轉(zhuǎn)染細胞支架復(fù)合物修復(fù)軟骨缺損的動物實驗

新西蘭大白兔12只(3月齡，雌雄不限，體質(zhì)量2.0～2.5 kg)，隨機分為3組。Ⅰ組:植入轉(zhuǎn)染組細胞與PLGA復(fù)合物;Ⅱ組:植入BMSCs與PLGA復(fù)合物;Ⅲ組:植入單純PLGA;每組4只。建立甲狀軟骨局部缺損的動物模型［6］，于左側(cè)做一1.0 cm ×1.0 cm全層軟骨缺損，不穿透喉黏膜。將上述3組細胞支架復(fù)合物移植缺損處，縫線稍做固定。術(shù)后每日耳緣靜脈注射青霉素160萬單位，連續(xù)應(yīng)用3 d。術(shù)后觀察動物呼吸、活動及進食情況，分別于術(shù)后4和8周無痛處死動物，對所獲得的工程化軟骨進行大體和組織切片觀察。

1.9 統(tǒng)計學分析

應(yīng)用SPSS17.0軟件對各組結(jié)果進行統(tǒng)計分析。數(shù)值以均數(shù)±標準差表示。

2 結(jié)果

2.1 細胞培養(yǎng)

BMSCs剛接種時，其內(nèi)有血細胞混雜，成分不易分辨。3 d后首次換液，可見貼壁細胞呈三角形、多角形或短梭形，部分區(qū)域有細胞的小集落形成，數(shù)個至數(shù)十個不等。6～7 d后貼壁的細胞體積增大，細胞形態(tài)基本一致，呈典型的成纖維細胞形態(tài)。10～12 d后貼壁的細胞逐漸增多并連接成片，呈魚群狀排列。傳代培養(yǎng)細胞比原代細胞成分純凈，2 d后大部分細胞貼壁，細胞形態(tài)較舒展，3～4 d可見細胞增殖，呈典型的長梭形，細胞數(shù)明顯增加，7～8 d長滿瓶底(圖1)。

2.2 感染后hCDMP1基因的表達

感染后24 h，A和B兩組細胞在熒光倒置顯微鏡下均可見到少量綠色熒光，48 h綠色熒光明顯增多，72 h則可見到大量綠色熒光，熒光與細胞輪廓一致，轉(zhuǎn)染率為90% 以上，持續(xù)14 d以上(圖2)，C組細胞未見綠色熒光。

2.3 RT-PCR檢測基因轉(zhuǎn)染后的CDMP1 mRNA表達

A組出現(xiàn)約443 bp大小的電泳條帶，和hCDMP1 cDNA大小一致。而B組、C組均未出現(xiàn)電泳條帶(圖3)。

圖3 基因轉(zhuǎn)染后BMSCs中hCDMP1 mRNA的表達Fig 3 Expression of hCDMP1 mRNA of BMSCs after transfection by RT-PCR

圖4 感染后BMSCs中hCDMP1蛋白的表達Fig 4 Expression of hCDMP1 protein of BMSCs after transfection by Western blot

經(jīng)計算機圖像分析，各組Ⅱ型膠原表達(以積分吸光度IA表示)IA(表2)。

2.4 免疫印跡法(Western blot)檢測CDMP1蛋白的表達

轉(zhuǎn)染組出現(xiàn)分子質(zhì)量大小約55.6 ku的明顯電泳條帶(與hCDMP1蛋白質(zhì)分子質(zhì)量相符)，而未轉(zhuǎn)染組和對照組則無電泳條帶顯示(圖4)，內(nèi)參β-actin大小是43 ku。

2.5 免疫組化方法檢測轉(zhuǎn)染后細胞Ⅱ型膠原的表達

轉(zhuǎn)染組胞質(zhì)出現(xiàn)較明顯Ⅱ型膠原的表達;而未轉(zhuǎn)染組和對照組顯色較弱(圖5)。

表2 感染后BMSCs細胞外基質(zhì)染色的吸光度值(IA)Table 2 Analysis of IAD of BMSCs after transfection(n=10)

2.6 轉(zhuǎn)染細胞支架復(fù)合物修復(fù)軟骨缺損的動物實驗

所有動物術(shù)后4～8 h均可以進食，24 h后活動基本正常，頸部切口Ι期愈合。

圖5 感染后BMSCs中Ⅱ膠原蛋白的表達Fig 5 Expression of collagen typeⅡ of BMSCs after transfection by immunohischemistry(×200)

術(shù)后4周和8周分別處死每組動物，對軟骨缺損修復(fù)區(qū)進行觀察。術(shù)后4周可見Ⅰ組動物缺損處色澤淡紅，表面光滑，和周圍軟骨基本平齊。Ⅱ、Ⅲ組缺損處大體形態(tài)無明顯差異，創(chuàng)面明顯，色澤暗紅，與周圍正常軟骨界限清晰。缺損處充填組織質(zhì)地較軟，創(chuàng)面均未見明顯感染及壞死表現(xiàn)。術(shù)后8周見Ⅰ組動物缺損處創(chuàng)面稍顯灰白，呈現(xiàn)軟骨樣外觀，表面光滑，與正常軟骨邊界模糊。Ⅱ、Ⅲ組動物缺損處創(chuàng)面淡紅，凹陷，質(zhì)地較韌，與周圍正常軟骨界限清晰(圖6)。

對所獲得的組織工程化軟骨進行組織學觀察。4周時，缺損區(qū)未見明顯炎性反應(yīng)。Ⅰ組動物頸部缺損區(qū)有不成熟的軟骨細胞生成，無明顯軟骨陷窩，Ⅱ型膠原蛋白和甲苯胺藍染色陽性，Ⅱ、Ⅲ組動物頸部缺損區(qū)無明顯軟骨細胞生成，Ⅱ型膠原蛋白和甲苯胺藍染色陰性。8周時，Ⅰ組動物頸部缺損處軟骨樣細胞明顯增多，大量軟骨陷窩形成，Ⅱ型膠原蛋白和甲苯胺藍染色陽性，Ⅱ、Ⅲ組動物缺損區(qū)基本為纖維瘢痕組織代替，Ⅱ型膠原蛋白和甲苯胺藍染色陰性(圖7，8，表3)。

表3 工程化軟骨GAG、Ⅱ型膠原陽性染色面積和吸光度分析Table 3 Analysis of GAG and collagenⅡpositive area and intensity of different groups(，n=10)

表3 工程化軟骨GAG、Ⅱ型膠原陽性染色面積和吸光度分析Table 3 Analysis of GAG and collagenⅡpositive area and intensity of different groups(，n=10)

*p＜0.05 compared with other groups.

group 4 weeks 8 weeks GAG Ⅰ 41.36±1.62* 85.75±1.93*5.09±0.49 5.53±0.32Ⅱ 7.57±0.42 8.67±0.52Ⅲ 6.71±0.48 7.31±0.61 collagenⅡ Ⅰ 37.99±2.39* 84.62±2.63*Ⅱ 6.01±0.44 6.38±0.25Ⅲ

3 討論

圖6 轉(zhuǎn)染細胞支架復(fù)合物移植后修復(fù)軟骨缺損的大體觀察Fig 6 The transfected and untransfected cell scaffold culture systems were implanted into the rabbit thyroid cartilage defects and the culturing systems were analyzed at the gross level

hCDMP1即生長分化因子5，是轉(zhuǎn)化生長因子β(TGF-β)超家族的成員，也是骨形態(tài)發(fā)生蛋白家族中的新亞型［7-11］，在軟骨形成的初期主要是促進間充質(zhì)前軟骨細胞黏附、聚集和分化，后期則顯著促進軟骨細胞的成熟和肥大。目前國內(nèi)外已經(jīng)將CDMP1用于軟骨組織工程，但多數(shù)學者都是將CDMP1蛋白添加到體外研究體系中或注射到體內(nèi)進行實驗。雖然取得了較為可觀的結(jié)果，但是作用時間短、CDMP1蛋白的快速降解、反復(fù)追加致成本價格的昂貴以及反復(fù)干預(yù)的操作繁瑣限制了它的應(yīng)用。通過將外源的CDMP1基因?qū)爰毎⑹蛊浞€(wěn)定表達的基因療法是解決以上問題的良方。用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染法將CDMP1基因?qū)胪霉撬杌|(zhì)干細胞，用以修復(fù)兔關(guān)節(jié)軟骨缺損。在用CDMP1轉(zhuǎn)染同源BMSCs植入兔關(guān)節(jié)軟骨缺損處8周后，修復(fù)的軟骨表面形態(tài)可以與分化成熟的透明軟骨相比擬，而且軟骨下組織也完全由接近宿主軟骨下骨的新生厚層骨組織修復(fù)。用脂質(zhì)體介導(dǎo)法成功將hCDMP1基因轉(zhuǎn)染兔BMSCs并誘導(dǎo)成軟骨細胞，但所得工程化軟骨不及正常軟骨［1］。本實驗采用的腺病毒載體缺失E1區(qū)，即病毒復(fù)制缺失，故作為載體進行基因治療時不會在體內(nèi)不斷復(fù)制，也不會整合到宿主染色體內(nèi)，因而對于機體相對是安全的，但基因表達的可控性有待提高。本實驗采用腺病毒攜帶hCDMP1基因成功導(dǎo)入兔BMSCs，RT-PCR及Western blot等方法證實目的基因得到了穩(wěn)定表達，并持續(xù)2周以上，MTT檢測結(jié)果證明腺病毒攜帶hCDMP1基因感染BMSCs未引起B(yǎng)MSCs的過度增殖或抑制 (結(jié)果未在本文顯示)，說明腺病毒轉(zhuǎn)染相對是安全的，這為基因轉(zhuǎn)染應(yīng)用于軟骨組織工程提供了依據(jù)。

PLGA具有良好的機械強度、生物相容性和可控制性［12］，廣泛應(yīng)用于組織工程和藥物緩釋材料等方面。PLGA具有極高的生物相容性，安全性好，異物反應(yīng)及免疫原性也極低，物理和化學性能穩(wěn)定，為BMSCs增殖和分化提供適宜的三維空間。

軟骨細胞間質(zhì)的化學成分主要包括膠原蛋白和蛋白多糖。軟骨組織中的膠原主要是Ⅱ型膠原，占膠原總量的90%以上。因此Ⅱ型膠原蛋白和糖胺聚糖是軟骨細胞的特殊標志。本實驗中，基因轉(zhuǎn)染后BMSCs合成細胞外基質(zhì)的能力增強，與對照組和未轉(zhuǎn)染組相比，轉(zhuǎn)染組Ⅱ型膠原蛋白和糖胺聚糖表達水平顯著提高，因此提示hCDMP1有誘導(dǎo)BMSCs向軟骨細胞表型分化的能力。動物實驗中觀察到4周時Ⅰ組動物頸部缺損區(qū)新生組織的Ⅱ型膠原蛋白和甲苯胺藍染色陽性，Ⅱ、Ⅲ組動物頸部缺損區(qū)上述染色陰性。8周時Ⅰ組缺損區(qū)類軟骨樣細胞增多，Ⅱ型膠原蛋白和甲苯胺藍染色陽性面積增多，Ⅱ、Ⅲ組缺損區(qū)為纖維組織修復(fù)，上述染色無明顯陽性。Ⅰ組Ⅱ型膠原蛋白和糖胺聚糖的分泌強于其他兩組，說明腺病毒攜帶hCDMP1基因感染BMSCs能使其持續(xù)表達具有生物學效應(yīng)的hCDMP1。

本實驗采用腺病毒攜帶hCDMP1基因感染的BMSCs與PLGA復(fù)合修復(fù)喉軟骨缺損，從形態(tài)和組織學上分別證實了缺損區(qū)類軟骨的形成和喉軟骨缺損的成功修復(fù)。綜上所述，用轉(zhuǎn)染效率較高的腺病毒攜帶hCDMP1基因感染BMSCs，然后與PLGA三維生物支架結(jié)合所獲得的組織工程化軟骨可以有效地修復(fù)喉軟骨缺損。

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