張劉平，唐 華，鄭曰勇，周小雨，朱 萌，寇 耀

(重慶醫(yī)科大學附屬第一醫(yī)院胃腸外科，重慶400016)

惡病質在腫瘤患者中非常普遍，約80%的癌癥晚期患者都會出現(xiàn)惡病質狀態(tài)，且在腫瘤引起的死亡患者中占約占30%［1］，但是目前臨床缺乏有效治療方法。骨骼肌消耗是腫瘤惡病質最突出的特征，導致患者活動減少，生命質量降低，生存時間縮短［2］。腫瘤壞死因子受體相關因子6(TRAF6)是腫瘤壞死因子(tumor necrosis factor，TNF)超家族和Toll樣/白細胞介素-1受體(toll sample/interleukin-1 receptor，TIR)超家族重要的接頭分子，最近研究顯示，TRAF6可以通過調節(jié)蛋白降解的自噬溶酶體途徑(autophagy-lysosome pathway，ALP)和泛素蛋白酶體途徑(ubiquitin-proteasome pathway，UPP)，在饑餓、糖尿病、去神經(jīng)和腫瘤等引起的骨骼肌消耗中起到重要的調節(jié)作用［3－5］。Beclin-1是ALP標志性因子［6］，而UPP又是以 MuRF1和 MAFbx表達增高為特征［7］。蛋白酶體抑制劑MG132能夠抑制TRAF6的表達［8］，故本研究采用MG132治療腫瘤惡病質小鼠，觀察其對骨骼肌組織的消耗、TRAF6、Beclin-1、MuRF1和MAFbx基因表達的影響。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

SPF級BALB/c小鼠，雄性，6～8周齡，體質量20～24 g，重慶醫(yī)科大學實驗動物中心提供(合格證號:SCXK渝20020001);小鼠結腸腺癌 Colon26(C26)細胞系由重慶醫(yī)科大學病理教研室惠贈;MG132、MuRF1和 MAFbx一抗(Santa cruz公司);TRAF6一抗(Epitomics公司);Beclin1一抗(Proteintech公司);β-actin和二抗(凱基生物公司);Western blot相關試劑盒(碧云天生物有限公司);RTPCR相關試劑盒(TaKaRa公司);引物(上海生物工程技術有限公司)。

1.2 分組及建模

24只小鼠隨機分為對照組(HC)，惡病質組(CC)，MG132治療組(MG)。適應性喂養(yǎng)1周后，取小鼠結腸腺癌C26細胞0.1 mL(約1×106個/只)接種于后兩組小鼠右側腋窩皮下。荷瘤小鼠平均體質量開始顯著下降，并出現(xiàn)自發(fā)性活動減少、虛弱、精神不振等表現(xiàn)，即進入惡病質期。

1.3 治療和監(jiān)測

每天定時監(jiān)測小鼠體質量、毛發(fā)、精神狀態(tài)。從接種后第12天荷瘤小鼠進入惡病質起，給MG組每天腹腔注射0.1 mg/kg的MG132，HC和CC組給予等量0.9%氯化鈉注射液，治療7 d。于相同時間段采用ZH-ZFT型自發(fā)活動實驗視頻分析系統(tǒng)記錄小鼠第1天、第12天和第19天1 h內自發(fā)性活動總路程。第19天脫頸椎處死小鼠，稱量腫瘤、左側腓腸肌質量，小鼠去瘤體質量等于終末體質量減去腫瘤質量。

1.4 腓腸肌纖維橫切面積

腓腸肌組織常規(guī)制片，HE染色后，200倍光鏡下攝像，采用Image Pro Plus 6.0軟件測量各組200個腓腸肌纖維橫切面積。

1.5 RT-PCR檢測

提取腓腸肌RNA，測濃度和完整性后反轉錄合成cDNA。所需的引物見表1。使用SYBR Green Reahime PCR Master Mix試劑盒以合成的cDNA為模板進行PCR反應，反應體系:cDNA 2 μL，上下游引物各0.8 μL，染料混合液10 μL，加去離子水至20 μL;反應條件為:95℃預變性1 min;95℃變性5 s，58 ℃ 退火15 s，72 ℃ 延伸15 s，共 40 個循環(huán)。根據(jù)2－ΔΔct公式計算目的產(chǎn)物mRNA的相對轉錄水平。實驗重復3次。

1.6 Western blot檢測

提取腓腸肌組織蛋白、測濃度、轉膜、封閉、然后與相應 TRAF6、Beclin1、MAFbx 和 MuRF1、β-actin抗體孵育過夜、洗膜、再與相應二抗孵育、再洗膜、顯影。將目標蛋白與內參β-actin吸光度值的比值作為目標蛋白的相對表達水平。實驗重復3次。

表1 引物序列及產(chǎn)物長度Table 1 Primer sequence and product length

1.7 統(tǒng)計學分析

2 結果

2.1 小鼠一般狀況

從接種第5天開始CC和MG組小鼠皮下均可觸及腫瘤結節(jié)，第12天出現(xiàn)體質量顯著下降(P＜0.05)，并出現(xiàn)自發(fā)性活動減少(P＜0.05)、毛發(fā)變暗無光澤、虛弱、精神不振等惡病質癥狀，第19天與CC組相比，MG組小鼠終末去瘤體質量增加(P＜0.05)、自發(fā)性活動總路程增加(P＜0.05)(圖1，2)。

圖2 不同時間點各組小鼠1 h自發(fā)性活動總路程Fig 2 Total distances of spontaneous activity within one hour for different group of mice at different time points

2.2 腓腸肌重量和橫切面積

與HC組比較，CC和MG組小鼠的腓腸肌組織重量均降低(P＜0.05)、腓腸肌橫切面積減小(P＜0.05)。與CC組比較，MG組小鼠腓腸肌組織重量增長了31.6%(P＜0.05)，腓腸肌橫切面積增長了32.6%(P ＜0.05)(表2，圖3)。

表2 MG132對各組小鼠腓腸肌重量和橫切面積的影響Table 2 Effect of MG132 on the weight and crosscut area of gastrocnemius muscle(x ± s，n=8)

2.3 小鼠腓腸肌 TRAF6、Beclin1、MAFbx和MuRF1 mRNA表達水平

與HC組比較，CC和MG組小鼠的腓腸肌組織TRAF6、Beclin1、MAFbx和 MuRF1的 mRNA 表達水平均升高(P＜0.05)。與CC組比較，MG組小鼠腓腸肌組織 TRAF6、Beclin1、MAFbx和 MuRF1的mRNA表達水平分別降低了56.3%、65.8%、54.5%和57.3%(均P ＜0.05)(圖4)。

圖3 各組小鼠腓腸肌組織橫切面HE染色Fig 3 Fiber cross-section of gastrocnemius muscle in each group mice by HE staining(×200)

圖4 各組小鼠腓腸肌TRAF6、Beclin1、MAFbx和MuRF1 mRNA相對表達水平Fig 4 MRNA relative expression levels of TRAF6，Beclin1，MAFbx and MuRF1 in gastrocnemius muscle of different groups of mice(x ± s，n=3)

2.4 小鼠腓腸肌 TRAF6、Beclin1、MAFbx和MuRF1蛋白表達水平

蛋白表達水平與mRNA表達水平趨勢相同，與HC組比較，CC和MG組小鼠的腓腸肌組織TRAF6、Beclin1、MAFbx和MuRF1的蛋白表達水平均升高(P＜0.05)。與CC組比較，MG組小鼠腓腸肌組織TRAF6、Beclin1、MAFbx和MuRF1的蛋白表達水平分別降低了54.0%(0.872±0.072 vs 0.401±0.028，P ＜0.05)、59.2%(0.901±0.081 vs 0.368±0.022，P ＜0.05)、49.9%(0.866±0.079 vs 0.434±0.037，P＜0.05)和48.6%(0.799±0.073 vs 0.411±0.031，P ＜0.05)(圖5)。

圖5 各組小鼠腓腸肌TRAF6、Beclin1、MAFbx和MuRF1蛋白表達水平Fig 5 Protein levels of TRAF6，Beclin1，MAFbx and MuRF1 in gastrocnemius muscle of different groups of mice(x ± s，n=3)

3 討論

腫瘤惡病質是以傳統(tǒng)的營養(yǎng)支持不能被完全逆轉的進行性骨骼肌組織減少，并導致進一步功能損害為特征的多因子綜合征［9］。肌肉消耗和惡病質是導致癌癥患者死亡的直接原因，有效地阻止或逆轉骨骼肌消耗是腫瘤惡病質治療的重要組成部分。

TRAF6是 TRAFs家族7個密切相關蛋白(TRAF1-7)的一種，因其特殊的結構域而位于TNF和TLR兩大超家族誘導的信號匯合的中心點，廣泛參與炎性反應、骨代謝、乳腺發(fā)育、淋巴結的形成、細胞增殖和胚胎發(fā)育等。最新研究顯示，TRAF6在饑餓、糖尿病、去神經(jīng)和腫瘤等引起的骨骼肌消耗中也發(fā)揮重要作用［3－5］。蛋白酶體抑制劑成為目前研究的熱點［10］，而MG132是一種有效的、可逆的醛基肽類特異性26S蛋白酶體抑制劑，能夠抑制TRAF6的表達［8］。本實驗發(fā)現(xiàn)，與 CC組比較，經(jīng) MG132治療后小鼠去瘤體質量增加，自發(fā)性活動量提高，腓腸肌重量和橫切面積均增長，同時TRAF6的mRNA和蛋白表達水平均減低，推測MG132改善骨骼肌消耗可能與抑制TRAF6有關。

蛋白質的降解目前主要有3條途徑:自噬溶酶體途徑(ALP)、泛素蛋白酶體途徑(UPP)和鈣依賴蛋白酶途徑，而ALP和UPP是機體修復或消除異常蛋白質的兩種最主要的途徑。UPP在腫瘤惡病質肌肉蛋白質的降解中起至關重要的作用，該途徑以兩個E3泛素連接酶MuRF1和MAFbx表達增高為特征，抑制MuRF1或MAFbx的表達能改善腫瘤惡病質肌肉萎縮和蛋白降解［7］。ALP在骨骼肌的肌原纖維蛋白質水解中所起的重要作用又是以Beclin1表達增高為特征［6］。進一步證據(jù)表明，在不同的萎縮條件下，這兩條途徑是通過一種協(xié)調的方式來增加蛋白質的降解。TRAF6可調控NF-κB，AP-1和(PI3K)/Akt等多條信號通路［5，11］，最終抑制 UPS 和ALP途徑，在腫瘤惡病質引起的骨骼肌消耗中發(fā)揮作用［5］。本實驗也發(fā)現(xiàn)，隨著TRAF6表達的減少，Beclin1、MAFbx和 MuRF1的 mRNA和蛋白表達水平也降低，推測MG132可能抑制腓腸肌TRAF6的表達，阻斷ALP和UPP途徑，對腫瘤惡病質骨骼肌消耗起到保護作用，但是MG132是如何抑制TRAF6的表達，且具體通過哪些信號通路降低Beclin1、MAFbx和MuRF1的表達仍需進一步的研究。

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