何丁文，殷嫦嫦，顧玉榮，陳偉才，矢慶明，殷 明*

(南昌大學(xué)1.第二附屬醫(yī)院骨一科;2.研究生院醫(yī)學(xué)部，江西南昌330006;3.九江學(xué)院分析與檢測(cè)實(shí)驗(yàn)室，江西九江332000)

周圍神經(jīng)因自我修復(fù)能力差，損傷后常導(dǎo)致感覺(jué)、運(yùn)動(dòng)功能損害甚至殘疾，給社會(huì)和家庭帶來(lái)巨大損失和沉重的經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)，已成為全球所面臨的嚴(yán)峻健康問(wèn)題之一［1］，細(xì)胞移植治愈為治愈周圍神經(jīng)損傷提供了可能。胚胎干細(xì)胞、神經(jīng)干細(xì)胞等一直被認(rèn)為是移植治療神經(jīng)疾病的首選細(xì)胞，但其來(lái)源及倫理道德限制了其大規(guī)模應(yīng)用［2］。近期研究發(fā)現(xiàn)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞(bone mesenchymal stem cells，BMSCs)具有強(qiáng)大的自我增殖能力和多向分化潛能，不僅可向成骨細(xì)胞、成軟骨、成脂肪細(xì)胞分化，在特定條件下還可向神經(jīng)元樣細(xì)胞、星形膠質(zhì)樣細(xì)胞和少突膠質(zhì)樣細(xì)胞分化［3］，被作為周圍神經(jīng)組織工程的重點(diǎn)種子細(xì)胞進(jìn)行研究。本研究應(yīng)用bFGF和EGF體外誘導(dǎo)大鼠BMSCs向神經(jīng)樣細(xì)胞分化，探討其向神經(jīng)分化潛能及聯(lián)合誘導(dǎo)優(yōu)勢(shì)，為BMSCs移植治療周圍神經(jīng)疾患提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動(dòng)物:清潔級(jí)4周齡SD大鼠4只，雌雄不限，合格證號(hào):HNASLKJ20122049。

1.1.2 主要試劑:DMEM/F-12(Hyclone公司)，胎牛血清(FBS，Gibco公司)，胰蛋白酶、瓊脂糖、甘氨酸、SDS、TRIS(Solarbio 公司)，CD90-FITC、CD45-FITC單抗(eBioscience公司)，堿性成纖維生長(zhǎng)因子(bFGF)、表皮生長(zhǎng)因子(EGF)、兔抗大鼠膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)、甘油醛-3-磷酸脫氫酶(GAPDH)多克隆抗體(Peprotech公司)，兔抗神經(jīng)元特異性烯醇化酶(NSE)多克隆抗體(PL Laboratories公司)，辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗、高靈敏度化學(xué)發(fā)光檢測(cè)試劑盒、HiFi-MMLV cDNA第一鏈合成試劑盒(北京康為世紀(jì)生物科技有限公司)，預(yù)染彩虹蛋白Marker(Fermentas公司)，總蛋白提取試劑盒(普利萊基因技術(shù)有限公司)，GREENspin組織/細(xì)胞RNA快速提取試劑盒(北京莊盟國(guó)際生物基因科技有限公司)，PCR試劑盒、DNA Marker(北京全式金生物技術(shù)有限公司)。

1.2 方法

1.2.1 BMSCs的分離、純化和鑒定:全骨髓貼壁法分離BMSCs。P3代BMSCs常規(guī)消化離心后PBS重懸至細(xì)胞濃度為1×107/mL，100 μL每管分裝于EP管中，分別加入 CD90-FITC、CD45-FITC 單抗5 μL，室溫避光孵育30 min后流式細(xì)胞儀檢測(cè)。

1.2.2 BMSCs的誘導(dǎo):P3代 BMSCs消化后按1.5×105/mL接種至6孔板，24 h后更換成含1%FBS的DMEM/F-12培養(yǎng)液:1)對(duì)照組:不加生長(zhǎng)因子;2)EGF組:添加20 ng/mL EGF;3)bFGF組:添加20 ng/mL bFGF;4)EGF+bFGF組:添加20 ng/mL EGF和bFGF。倒置相差顯微鏡觀察并拍照。

1.2.3 Western blot檢測(cè)NSE、GFAP蛋白表達(dá)水平:誘導(dǎo)7 d后，按細(xì)胞總蛋白提取試劑盒提取各組細(xì)胞總蛋白，制備 SDS-PAGE 凝膠后上樣30 μg，70～120 V恒壓電泳，250 mA恒流轉(zhuǎn)膜70 min，5% ～20%脫脂牛奶封閉2～4 h，4℃孵育一抗 NSE抗體(1∶100)、GFAP 抗 體 (1∶1 000)及 GAPDH 抗 體(1∶2 000)過(guò)夜，洗膜，孵育二抗(1∶4 000)，顯影、定影，用Image J吸光度分析軟件對(duì)蛋白條帶進(jìn)行分析。

1.2.4 RT-PCR檢測(cè)NSE、GFAP mRNA表達(dá)水平:誘導(dǎo)7 d后，按RNA快速提取說(shuō)明書提取各組細(xì)胞總RNA，按說(shuō)明書進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄和擴(kuò)增后電泳，凝膠成像系統(tǒng)照相，Image J軟件分析，結(jié)果以 NSE區(qū)帶/GAPDH區(qū)帶的相對(duì)吸光度值和GFAP區(qū)帶/GAPDH區(qū)帶的相對(duì)吸光度值表示，引物由南京金斯瑞生物科技有限公司合成(表1)。

表1 RT－PCR引物序列及產(chǎn)物大小Table 1 RT－PCR primer sequence of target gene and product size

1.3 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析

用SPSS19.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(±s)表示，組間比較采用單因素方差分析，兩兩比較采用t檢驗(yàn)。

2 結(jié)果

2.1 大鼠BMSCs分離、純化及鑒定

原代培養(yǎng)9～12 d左右可達(dá)80% ～90%匯合(圖1A)，P3代BMSCs呈典型的長(zhǎng)梭形或扁平形，緊密漩渦樣排列(圖1B)。細(xì)胞表面骨髓基質(zhì)標(biāo)志CD90高達(dá) 98.72%，而造血細(xì)胞標(biāo)志 CD45僅1.05%(圖2)。

2.2 BMSCs神經(jīng)分化后形態(tài)學(xué)觀察

圖3 bFGF和EGF誘導(dǎo)后BMSCs形態(tài)變化Fig 3 BMSCs morphological changes induced by bFGF and EGF

EGF、bFGF及EGF+bFGF組誘導(dǎo)3 d后部分細(xì)胞體積變小，立體感增強(qiáng)(圖3A);7 d后bFGF和EGF+bFGF組細(xì)胞折光性增強(qiáng)，胞體為圓形或橢圓形，見(jiàn)簡(jiǎn)單的雙極和復(fù)雜的多極細(xì)胞，向周圍伸出突起并分支，呈典型的神經(jīng)元樣細(xì)胞形態(tài)(圖3D、E)，相鄰的突起間存在連接(圖3F)，EGF組僅見(jiàn)簡(jiǎn)單的雙極、三極細(xì)胞(圖3C)，而對(duì)照組罕見(jiàn)類似細(xì)胞(圖3B)。

2.3 Western blot檢測(cè)結(jié)果

EGF組、bFGF組和 EGF+bFGF組 NSE、GFAP蛋白表達(dá)高于對(duì)照組，bFGF組和EGF+bFGF組高于EGF組，且EGF組高于空白對(duì)照組，EGF+bFGF組高于bFGF組(P＜0.05)(圖4，表2)。

表2 誘導(dǎo)7 d各組NSE和GFAP蛋白相對(duì)表達(dá)水平Table 2 Relative expression of NSE and GFAP collagens in each group at 7 days after induction(x ± s，n=3)

圖4 bFGF和EGF對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞NSE和GFAP蛋白表達(dá)的影響Fig 4 Electrophoresis of NSE and GFAP proteins expression in bone marrow mesenchymal stem cells induced by bFGF and EGF

2.4 RT-PCR檢測(cè)結(jié)果

NSE、GFAP在 EGF組、bFGF組和 EGF+bFGF組均高于對(duì)照組，bFGF組和 EGF+bFGF組高于EGF組，且EGF組高于對(duì)照組(P＜0.05);EGF+bFGF組NSE高于bFGF組(P＜0.05);EGF+bFGF組GFAP與bFGF組無(wú)明顯差異(圖5)。

3 討論

圖5 bFGF和EGF對(duì)骨髓間充質(zhì)干細(xì)胞NSE和GFAP mRNA表達(dá)的影響Fig 5 NSE and GFAP mRNA expression in bone marrow mesenchymal stem cells induced by bFGF and EGF

BMSCs是一類未分化的具有多向分化潛能的成體干細(xì)胞，在特定條件下可向神經(jīng)表型分化［3］，目前常用的神經(jīng)定向誘導(dǎo)劑主要為抗氧化劑和生長(zhǎng)因子［4］，在各種誘導(dǎo)方法中化學(xué)誘導(dǎo)法分化快，但細(xì)胞壞死較多，細(xì)胞生長(zhǎng)狀態(tài)差于生長(zhǎng)因子誘導(dǎo)法［5］，生長(zhǎng)因子中bFGF、EGF的研究最多且應(yīng)用最廣泛，bFGF在胚胎期和成年期的中樞和周圍神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育中均有表達(dá)，維持神經(jīng)元和神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的存活，促進(jìn)交感和副交感神經(jīng)元的軸突生長(zhǎng)，能促進(jìn)損傷神經(jīng)的修復(fù)和突起生長(zhǎng)［6］;bFGF是腎上腺嗜鉻細(xì)胞瘤細(xì)胞-12(Adrenal pheochromocytoma cells-12，PC12)神經(jīng)突起延伸、人NPCs神經(jīng)再生及誘導(dǎo)神經(jīng)細(xì)胞分化的重要生長(zhǎng)因子［7］。EGF在神經(jīng)系統(tǒng)中可促進(jìn)神經(jīng)元軸突的延長(zhǎng)和維持神經(jīng)元的存活，具有絲裂原樣作用，可促進(jìn) BMSCs分化增殖［8］。bFGF、EGF對(duì)神經(jīng)前體細(xì)胞增殖具有協(xié)同作用［9］，對(duì)胚胎源性神經(jīng)干細(xì)胞在分化方向上的作用有明顯差異，bFGF干預(yù)后的子代細(xì)胞大多數(shù)表達(dá)神經(jīng)元特異性抗原標(biāo)記NSE、微管相關(guān)蛋白2(mirotubulin-associated protein 2，MAP2)等［7］，而 EGF 作用的子代細(xì)胞大多數(shù)為膠質(zhì)樣細(xì)胞［10］，聯(lián)合作用時(shí)以成神經(jīng)元樣細(xì)胞為主，對(duì)BMSCs的誘導(dǎo)可得到上述相同結(jié)果［11］。這些研究結(jié)果表明生長(zhǎng)因子的作用取決于作用的細(xì)胞類型、細(xì)胞分化階段及其輔助因子［7］。在神經(jīng)系統(tǒng)中NSE為成熟神經(jīng)元特異性標(biāo)志物［13］，GFAP 為星形膠質(zhì)細(xì)胞的特異性標(biāo)志物［14］。本研究應(yīng)用bFGF和EGF誘導(dǎo)BMSCs成神經(jīng)分化，細(xì)胞形態(tài)呈典型的神經(jīng)元樣細(xì)胞形態(tài)，部分相鄰的突起間存在連接，尤以EGF+bFGF組最為顯著。誘導(dǎo)后bFGF組和EGF+bFGF組NSE和GFAP蛋白及其mRNA顯著高于EGF組，且EGF+bFGF組NSE蛋白和mRNA表達(dá)量最高。從蛋白及mRNA水平發(fā)現(xiàn)對(duì)照組 BMSCs也表達(dá) NSE、GFAP，說(shuō)明BMSCs具有表達(dá)神經(jīng)和膠質(zhì)細(xì)胞標(biāo)志物的能力。

bFGF和EGF可促進(jìn)大鼠BMSCs向神經(jīng)細(xì)胞分化，聯(lián)合應(yīng)用時(shí)效果最顯著，但各組所得神經(jīng)元和星形膠質(zhì)細(xì)胞比例不同，且bFGF誘導(dǎo)BMSCs向神經(jīng)分化的能力強(qiáng)于EGF。另外，盡管本實(shí)驗(yàn)從細(xì)胞形態(tài)、特異性標(biāo)志及mRNA方面證明了神經(jīng)細(xì)胞的形成，但所得細(xì)胞是否存在功能不能完全依賴于此，如細(xì)胞之間的連接是否為突觸聯(lián)系、相連的神經(jīng)突起中是否有釋放神經(jīng)遞質(zhì)的突觸小泡及神經(jīng)元樣細(xì)胞是否有神經(jīng)電位等問(wèn)題均需進(jìn)一步研究證明。

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