周中運，范春雷，竇曉兵，胡林峰，錢 穎

(浙江中醫(yī)藥大學生命科學學院，浙江杭州 310053)

姜黃素(Curcumin，CUR)是從姜科姜黃屬(Curcuma longaL.)植物姜黃、莪術、郁金等的根莖中提取得到的一種植物多酚，也是中藥姜黃發(fā)揮藥理作用的重要活性成分。系列研究表明CUR具有降血脂、抗氧化、抗炎、抗動脈粥樣硬化和抗腫瘤等多種生物學效應［1－5］。近年來姜黃素已成為國內(nèi)外的研究熱點，涉及的研究領域也越來越廣泛。本研究以人正常肝細胞(L-02)作為實驗對象，應用雙向凝膠電泳和質(zhì)譜技術初步研究CUR對人正常肝細胞蛋白質(zhì)組的影響，從中篩選出表達量變化最大的兩種蛋白質(zhì)分別為角蛋白1(Cytokeratin 1，CK1)和內(nèi)質(zhì)網(wǎng) 蛋 白 19(Endoplasmicreticulum protein 19，ERp19)，用Western blot進一步進行驗證，從蛋白質(zhì)表達水平上探討CUR藥理作用的分子機制，也為揭示CUR藥理作用分子機制提供了新的思路。

1 材料與方法

1.1 實驗材料與儀器 人正常肝細胞L-02細胞系(中國科學院上海細胞研究所);姜黃素(批號20100609)購自上海三愛思試劑有限公司;固相pH梯度膠條 (IPG strip pH 4-7，24 cm)(批號922804E)均購自 Bio-Rad Laboratories公司;2-D Quant Kit蛋白定量試劑盒(批號0807-03)購自GE healthcare公司;兔抗人抗體(CK1)(批號 bs-1244R)購于BIOSS公司，兔抗人抗體(ERp19)(批號O95881)購于Abcam公司。EttanTMIPGphorTM等電聚焦電泳儀，EttanTM DALTSix垂直板電泳儀，UMAX ImageScanner凝膠掃描儀，Image Master 2D Platinum 6.0雙向電泳凝膠圖像分析軟件，均購自Amersham BioSciences公司，Biofuge stratos高速冷凍離心機為德國Heraeus公司產(chǎn)品，UV8200分光光度計為日本日立公司產(chǎn)品，飛行時間串聯(lián)質(zhì)譜儀MALDI TOF/TOFTMAnalyzer 4800購自美國應用生物系統(tǒng)公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 細胞培養(yǎng) 用10%的滅活胎牛血清、含青霉素和鏈霉素的RPMI1640培養(yǎng)液在37℃、5%CO2條件下培養(yǎng)，待細胞呈對數(shù)生長時即開始實驗。隨機將人正常肝細胞L-02分成兩組，對照組不作任何處理，姜黃素組以 25 mol·L－1［6－7］姜黃素處理 L-02細胞24 h。

1.2.2 細胞總蛋白提取 24 h后，分別收集兩組細胞于試管中，各加入2 ml細胞裂解液(30 mmol·L－1Tris，8 mol·L－1尿素，4%CHAPS，pH 8.5)，4℃孵育1 h。置冰上超聲，超聲后用4℃，12 000 r·min－1離心30 min，取上清用2-D Quant Kit測定蛋白質(zhì)濃度，置－80℃保存。

1.2.3 雙向電泳 將各組蛋白質(zhì)的樣品和水化液(8 mol·L－1尿素，2%CHAPS，13 mmol·L－1DTT，0.5%IPG buffer，0.002% 溴酚藍)混合后共 450 μl(每塊膠蛋白質(zhì)上樣量為300 μg，每組做3塊重復膠)，制成第一向等電聚焦體系，采用膠內(nèi)泡漲的方法上樣。等電聚焦的參數(shù):30 V，12 h;500 V，1 h;1000 V，1 h;8 000 V，8 h。等電聚集后，膠條于平衡液Ⅰ(1%DTT，50 mmol·L－1Tris-HCl，6 mol·L－1尿素，30%甘油，2%SDS，0.002% 溴酚藍)、平衡液Ⅱ(4% 碘乙酰胺，50 mmol·L－1Tris-HCl，6 mol·L－1尿素，30% 甘油，2%SDS，0.002% 溴酚藍)中各平衡15 min后轉移到第二向已制好的12.5%SDSPAGE膠上，用0.5%瓊脂糖封頂，進行第二向電泳，電泳參數(shù)設定為:30 W，45 min;90 W，6 h。直到溴酚藍染料遷移至膠的底部邊緣結束電泳。

1.2.4 圖像掃描分析 電泳結束后，取出凝膠轉移到染色盒里進行硝酸銀染色。所得的蛋白質(zhì)組圖譜使用UMAX ImageScanner凝膠掃描儀及LabScan軟件進行掃描。然后用Image Master 2D Platinum 6.0分析，進行點識別、背景消除、點匹配及差異蛋白質(zhì)分析，獲得兩組比較后的差異蛋白質(zhì)點。

1.2.5 差異蛋白點的質(zhì)譜鑒定 從膠內(nèi)挖取某些差異蛋白點后，進行脫色、膠內(nèi)胰酶酶切和肽段提取，然后用基質(zhì)輔助激光解析電離飛行時間質(zhì)譜(MALDI-TOF-MS)進行肽質(zhì)量指紋圖譜分析。通過Mascot軟件，在蛋白質(zhì)數(shù)據(jù)庫中搜索與肽質(zhì)量指紋圖譜數(shù)據(jù)相匹配的蛋白質(zhì)，從而鑒定出有差異的蛋白質(zhì)。

1.2.6 Western blot鑒定 取用上述已經(jīng)定量的兩組細胞總蛋白樣品融解，蛋白樣品先用10%SDSPAGE凝膠進行分離，然后用濕轉法將蛋白轉移到PVDF膜上，5%脫脂奶粉對膜進行封閉，按照蛋白Mark標志將膜裁剪，分別用1∶400的CK1和1∶5 000的ERp19兔抗人一抗孵育，1∶4 000羊抗兔的二抗孵育，ECL顯色，凝膠成像系統(tǒng)對圖像進行采集。

1.2.7 統(tǒng)計學處理 采用SPSS 11.0統(tǒng)計軟件分析數(shù)據(jù)，實驗數(shù)據(jù)以±s表示，采用方差分析比較各組間差異。

2 結果

2.1 雙向銀染圖譜的分析 銀染蛋白質(zhì)圖譜經(jīng)Image Master 2D Platinum 6.0軟件分析后，經(jīng)比較結果發(fā)現(xiàn)，對照組3塊凝膠的平均蛋白質(zhì)點數(shù)為521個，姜黃素作用后3塊凝膠的平均蛋白質(zhì)點數(shù)為587個。兩組比較，如果蛋白質(zhì)表達的量差異超過1倍(增加或者降低)，并且3塊膠中蛋白質(zhì)表達量變化的趨勢相一致，則被認為該蛋白質(zhì)表達差異是由藥物所引起，而不是樣品材料和操作過程所帶來的誤差。根據(jù)這個原則，共找到40個差異蛋白點，其在圖譜中的位置見Fig 1。

Fig 1 2-DE silver-staining patterns(pH 4－7，24 cm，Nonlinear strip)

2.2 差異表達點的質(zhì)譜鑒定 上述差異蛋白質(zhì)點經(jīng)過膠內(nèi)酶解后用MALDI-TOF-MS對其中差異最大的兩個蛋白質(zhì)進行鑒定，并與蛋白質(zhì)文庫進行比對分析后，這兩個蛋白的分子量與等電點被確定見Tab 1。結果顯示:姜黃素處理后角蛋白1和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白19表達均增高。

Tab 1 MS identified results of differentially expressed proteins

2.3 Western blot分析 Western blot結果表明人肝細胞L-02經(jīng)姜黃素處理后角蛋白1和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白19表達均明顯增高，與雙向質(zhì)譜鑒定的上調(diào)趨勢基本相同(Fig 2)。

3 討論

傳統(tǒng)中醫(yī)中姜黃具有破血行氣、通經(jīng)止痛的功能，用于胸脅刺痛，閉經(jīng)，風濕肩臂疼痛等。以往的大量研究也表明［7－8］，姜黃的主要活性成分姜黃素具抗氧化、抗腫瘤、抗炎以及對心血管系統(tǒng)、消化系統(tǒng)等多方面藥理作用。肝臟是體內(nèi)重要的代謝器官，肝細胞在其過程中發(fā)揮了主要的作用。機體中多種抗氧化的酶類及其它重要的活性因子主要是由肝細胞產(chǎn)生，而且進行生物氧化的線粒體也主要存在于肝細胞中。因此肝臟的保護顯得尤為重要，已有研究發(fā)現(xiàn)姜黃素對誘導的肝損傷具有保護作用［9－10］，本實驗室前期的研究表明，姜黃素能提高人肝癌細胞HepG2表面的低密度脂蛋白受體(LDLR)表達［6］，提示其對抗動脈粥樣硬化(AS)起積極的作用。但是，當姜黃素的濃度超過 30 μmol·L－1［6］后，則它能夠抑制 HepG2 細胞的生長，表明姜黃素也具有抗腫瘤的作用。本實驗從蛋白質(zhì)組學角度，應用雙向凝膠電泳、質(zhì)譜技術和蛋白免疫印跡來探討姜黃素對人正常肝細胞的作用機制，結果發(fā)現(xiàn)了2個明顯差異蛋白質(zhì)角蛋白1和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白19。

Fig 2 Effects of curcumin on expression of CK1 and ERp19

角蛋白(keratin)是最大的中間纖維亞組，分屬Ⅰ型和Ⅱ型中間纖維蛋白，目前已發(fā)現(xiàn)有50余種，主要分布于上皮組織細胞中［11－12］。在分化過程中，伴隨著各種角蛋白的基因表達改變，其中存在于基底上層的角蛋白1常被作為早期正常分化的標志［13］。硫氧還蛋白(Trx)被認為是除GSH和SOD系統(tǒng)之外的另一個內(nèi)源性抗氧化系統(tǒng)，硫氧還蛋白結構域是內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白19中主要的結構域，Trx是一個控制細胞氧化還原狀態(tài)的、廣泛表達的小分子蛋白質(zhì)，通過其活性中心硫氫鍵和二硫鍵的可逆轉換參與細胞內(nèi)的氧化還原過程［14］。

通過本實驗研究表明，加入姜黃素藥物組與空白對照組的蛋白質(zhì)差異明顯，其中表達量變化最大的角蛋白1和內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白19明顯上調(diào)。角蛋白1具有促分化作用，對于癌細胞以分裂為主的特性有抑制作用，能使癌細胞分裂降低，趨向分化;內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白19中的硫氧還蛋白結構域具有抗氧化作用。因此上調(diào)肝細胞角蛋白1和具硫氧還蛋白結構域的內(nèi)質(zhì)網(wǎng)蛋白19可能是姜黃素抗腫瘤、抗氧化作用的機制之一。

［1］趙革平，沃興德.姜黃素及其衍生物的抗氧化作用研究概況［J］.浙江中醫(yī)學院學報，1998，22(6):10－2.

［1］Zhao G P，Wo X D.The antioxidant reasch of curcumin and its derivatives［J］.J Zhejiang Med Univ，1998，22(6):10－ 2.

［2］Fan C，Wo X，Qian Y，et al.Effect of curcumin on the expression of LDL receptor in mouse macrophages［J］.J Ethnopharmacol，2006，105(1－2):251－4.

［3］沃興德，洪行球，趙革平，等.姜黃素對低密度脂蛋白和脂蛋白(a)代謝的影響［J］.中國動脈硬化雜志，1999，7(4):339－41.

［3］Wo X D，Hong X Q，Zhao G P，et al.The effects of curcumin on the metabolism of LDL and lipoprotein(a)［J］.J Chin Arteriosclerosis，1999，7(4):339－41.

［4］丁志山，高承賢，陳鈮鈹，等.姜黃素具有抑制血管生成與誘導腫瘤細胞凋亡雙重作用［J］.中國藥理學通報，2003，19(2):171－3.

［4］Ding Z S，Gao C X，Chen L P，et al.Effects of curcumin:antiangiogenesis and induction of SMMC-7721 cell apoptosis［J］.Chin Pharmacol Bull，2003，19(2):171－3.

［5］錢 穎，范春雷，竇曉兵，等.姜黃素對293細胞固醇調(diào)控報告系統(tǒng)的作用［J］.中國藥理學通報，2006，22(7):828－30.

［5］Qian Y，F(xiàn)an C L，Dou X B，et al.Efect of curcumin on sterol regulatory report system in HEK-293［J］.Chin Pharmacol Bull，2006，22(7):828－30.

［6］竇曉兵，沃興德，范春雷，等.姜黃素對人肝細胞HepG2中低密度脂蛋白受體基因表達影響的研究［J］.中國藥學雜志，2007，42(8):572－5.

［6］Dou X B，Wo X D，F(xiàn)an C L，et al.Effect of curcumin on the expression of low density lipoprotein Receptor in HepG2 cell line［J］.Chin Pharm J，2007，42(8):572－5.

［7］李 強，趙曙光，王旭霞，等.姜黃素對人肝細胞氧化應激及胰島素抵抗的影響［J］.山西醫(yī)科大學學報，2010，41(4):300－303.

［7］Li Q，Zhao S G，Wang X X，et al.Effect of curcumine on intracellular reactive oxygen species and insulin resistance in cultured human hepatocytes［J］.J Shanxi Med Univ，2010，41(4):300－3.

［8］歐陽英英，李 珂，榮 爽，等.HO-1在姜黃素拮抗乙醇所致肝細胞氧化損傷過程中的作用［J］.華中科技大學學報，2010，39(1):82－6.

［8］Ouyang Y Y，Li K，Rong S，et al.Involvement of heme oxygenase-1 in the protective actions of curcumin against ethanol-induced oxidative damage in rat primary hepatocytes［J］.Acta Med Univ Sci Technol Huazhong，2010，39(1):82－6.

［9］El-Agamy D S.Comparative effects of curcumin and resveratrol on aflatoxin B(1)-induced liver injury in rats［J］.Arch Toxicol，2010，84(5):389－96.

［10］Rong S，Zhao Y，Bao W，et al.Curcumin prevents chronic alcoholinduced liver disease involving decreasing ROS generation and enhancing antioxidative capacity［J］.Phytomedicine，2012，19(6):545－50.

［11］Godsel L M，Hobbs R P，Green K J.Intermediate filament assembly:Dynamics to disease［J］.Trends Cell Biol，2008，18(1):28－37.

［12］Coulombe P A，Omary M B.‘Hard’and‘soft’principles defining the structure，function and regulation of keratin intermediate filaments［J］.Curr Opin Cell Biol，2002，14(1):110－22.

［13］Akunda J K，Lao H C，Lee C A，et al.Genetic deficiency or pharmacological inhibition of cyclooxygenase-1 or-2 induces mouse keratinocyte differentiationin vitroandin vivo［J］.FASEB J，2004，18(1):185－7.

［14］Galligan J J，Petersen D R.The human protein disulfide isomerase gene family［J］.Hum Genomics，2012，6(1):6.