汪亞勤，曹水娟，殷嘉珺，黃建明，翁鴻博

(復(fù)旦大學(xué)藥學(xué)院，上海 201203)

毛喉鞘蕊花Coleμs forskohlii(Willd)Briq.系唇形科 Labiatae鞘蕊花屬Coleμs Loμr.植物，產(chǎn)于印度和我國云南省等地，主要用于治療感冒、咳喘等疾病。上世紀(jì)70年代，印度學(xué)者 Bhat等［1－2］從印度產(chǎn)毛喉鞘蕊花中分離到具有明顯降壓和強(qiáng)心作用的半日花烷型二萜，并由此引起人們對它的關(guān)注。國外研究主要集中于印度產(chǎn)品種中的有效成分佛司可林(forskolin)，其具有強(qiáng)大的腺苷酸環(huán)化酶激活作用，在臨床上用于治療心血管疾病、青光眼、支氣管哮喘等［3－6］。國產(chǎn)品種中尚未分離得到佛司可林，但分離得到了與之結(jié)構(gòu)類似的異佛司可林，據(jù)報道具有平喘解痙，抑制血小板凝聚等作用［7－8］，從國產(chǎn)品種中已經(jīng)分離得到與印度產(chǎn)品種中相同的二萜和一些新的二萜類化合物，但相關(guān)的藥理活性研究較少［9－11］。

在前期工作中，我們采用大孔樹脂等提取純化技術(shù)，獲得了毛喉鞘蕊花提取物，并進(jìn)行了化學(xué)成分研究［12］。本文主要研究從國產(chǎn)毛喉鞘蕊花提取物中分離得到的5種半日花烷型二萜類化合物即異佛司可林、佛司可林G、J、A、I以及國外產(chǎn)毛喉鞘蕊花中主要有效成分佛司可林對His、ACh誘導(dǎo)的豚鼠離體氣管平滑肌標(biāo)本收縮的影響，比較其舒張氣管平滑肌的作用，為國產(chǎn)毛喉鞘蕊花的進(jìn)一步研究與開發(fā)提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 試驗動物 豚鼠，♀♂不限，體質(zhì)量250－350 g(上海西普爾－必凱實驗動物有限公司提供)。

1.1.2 試劑 磷酸組胺(上海晶天生物科技有限公司);氯化乙酰膽堿(上海晶天生物科技有限公司);氨茶堿(上海信誼金朱藥業(yè)有限公司);佛司可林(純度大于98%，華誠生物科技有限公司);異佛司可林、佛司可林G、佛司可林J、佛司可林A、佛司可林I從國產(chǎn)毛喉鞘蕊花中分離得到，經(jīng)MS、1HNMR、13C-NMR確定結(jié)構(gòu)，采用HPLC-ELSD法測得其純度大于98%。其余試劑均為國產(chǎn)分析純。

1.1.3 儀器 Hu-1型肌肉張力換能器(淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司);MD3000型生物信號采集處理系統(tǒng)(淮北正華生物儀器設(shè)備有限公司);超級恒溫槽(上海衡平儀器儀表廠);離體器官恒溫肌槽(定制)。

1.2 方法

1.2.1 樣品溶液的配制 取異佛司可林、佛司可林、佛司可林G以PEG400溶解至所需濃度，備用。佛司可林A，佛司可林 I ，先以100 μl二氯甲烷溶解，佛司可林J先以100 μl丙酮溶解，再用PEG400配成所需濃度，置60℃水浴中2 h，使有機(jī)溶劑完全揮發(fā)，備用。

1.2.2 豚鼠離體氣管平滑肌實驗 取豚鼠，♀♂不拘，頭擊處死。切開頸部皮膚及肌肉，取出氣管置于通有95%O2+5%CO2混合氣的 K reb’s營養(yǎng)液(NaCl 6.9 g、KCl 0.35 g、MgSO4·7H2O 0.29 g、KH2PO40.16 g、NaHCO32.1 g、CaCl20.28 g、Glucose 2 g、加蒸餾水至1 000 ml)中，去除氣管周圍結(jié)締組織后將氣管剪成寬約3～5 mm、長約30 mm的螺旋條。置于含30 ml Kreb’s營養(yǎng)液的離體器官恒溫肌槽(37℃)中，通95%O2+5%CO2混合氣，下端固定于離體器官恒溫肌槽底部，上端連接于張力換能器，調(diào)節(jié)負(fù)荷為2 g，用MD3000型生物信號采集處理系統(tǒng)記錄張力的變化，每30 min換液1次，穩(wěn)定1 h［13］。

1.2.3 對His誘導(dǎo)的收縮反應(yīng)的影響 加入3.3 mmol·L－1組胺溶液，使其終濃度為 3 3 μmol·L－1，待組胺引起氣管條最大收縮時，換液，洗氣管條5次，換液，待基線平穩(wěn)后，再次加入His溶液，記錄標(biāo)本張力值，待其達(dá)到收縮峰值后，采用累積劑量法加入樣品溶液或空白對照溶液，或一次性加入陽性對照液 4 4 mmol·L－1氨茶堿，其終濃度為 4 4 μmol·L－1。觀察記錄藥物作用3 min時氣管條的張力值，計算解痙百分率［解痙百分率/%=(給藥前張力值－給藥后張力值)/給藥前張力值×100%］。

1.2.4 對ACh誘導(dǎo)的收縮反應(yīng)的影響 加入1.1 mmol·L－1氯化乙酰膽堿溶液，使其終濃度為11 μmol·L－1，待ACh引起氣管條最大收縮時，換液，洗氣管條5次，換液，待基線平穩(wěn)后，再次加入ACh溶液，記錄標(biāo)本的張力值，待其達(dá)到收縮峰值后，采用累積劑量法加入樣品溶液或空白對照溶液，或一次性加入陽性對照溶液44 mmol·L－1氨茶堿，其終濃度為44 μmol·L－1。觀察記錄藥物作用3 min時氣管條的張力值，計算解痙百分率。

2 結(jié)果

2.1 佛司可林和異佛司可林對離體豚鼠氣管條的影響

2.1.1 對His誘導(dǎo)的收縮反應(yīng)的影響 氣管條在Kreb’s營養(yǎng)液中平衡后，加入His引起氣管條的收縮?？瞻捉M給藥前后差異無統(tǒng)計學(xué)意義，各給藥組均可明顯舒張His所致的的豚鼠氣管平滑肌的收縮，其中佛司可林在較低濃度(6.1、9.7 μmol·L－1)時舒張幅度不再增長，異佛司可林至更高濃度(9.7、24.4 μmol·L－1)時舒張幅度仍有增長趨勢，EC50值分別為(4.1 ±1.2)、(7.8 ±2.7)μmol·L－1，見 Fig 1。

Fig 1 Effects of forskolin，isoforskolin on the contraction of isolated guinea pig trachea induced by His(±s，n=6)

2.1.2 對ACh誘導(dǎo)的收縮反應(yīng)的影響 氣管條在Kreb's營養(yǎng)液中平衡后，加入ACh引起氣管條的收縮?？瞻捉M給藥前后差異無統(tǒng)計學(xué)意義，各給藥組均可明顯舒張ACh所致的的豚鼠氣管平滑肌的收縮，佛司可林與異佛司可林的舒張幅度隨濃度增加而增大，且均在較高濃度(24.4 μmol·L－1)時，舒張幅度隨濃度增加而僅有微小增大，最大舒張幅度佛司可林要大于異佛司可林，EC50值分別為(16.6±3.6)、(73.4 ±23.6)μmol·L－1，見 Fig 2。

2.2 佛司可林G、J、A、I對His誘導(dǎo)的離體豚鼠氣管條收縮反應(yīng)的影響 氣管條在Kreb's營養(yǎng)液中平衡后，His引起了氣管條的收縮。空白組給藥前后差異無統(tǒng)計學(xué)意義，各給藥組均可明顯舒張His所致的的豚鼠氣管平滑肌的收縮，其中佛司可林G、J、A、I舒張幅度隨濃度增加而增大，最大舒張幅度從大到小依次為佛司可林 J、G、A、I，佛司可林 G、J、A、I的 EC50值分別為(18.8 ±4.5)、(7.1 ±6.2)、(24.3 ±12.1)、(64.7 ±9.5)μmol·L－1，見 Fig 3。

Fig 2 Effects of forskolin，isoforskolin on the contraction of isolated guinea pig trachea induced by ACh(±s，n=6)

Fig 3 Effects of forskolinG，J，A，I on the contraction of isolated guinea pig trachea induced by His(±s，n=6)

2.3 6 種佛司可林類化合物對His誘導(dǎo)的收縮反應(yīng)影響的比較 繪制各化合物的量效關(guān)系曲線(Fig 4)，可觀察到各給藥組均可明顯舒張His所致的豚鼠氣管平滑肌的收縮，佛司可林、佛司可林J、異佛司可林、佛司可林G使氣管平滑肌的舒張分別在濃度為 6.1、11.0、12.0、36.7 μmol·L－1時不再增長，而佛司可林A、佛司可林I在累積濃度為45.9 μmol·L－1時氣管平滑肌的舒張仍呈增長的趨勢。其舒張作用的排列(效價由大到小):佛司可林，佛司可林J，異佛司可林，佛司可林G，佛司可林A，佛司可林I。

3 討論

氣管平滑肌上主要分布有β2受體、M受體和H1受體。β2受體興奮使支氣管平滑肌舒張，M受體和H1受體興奮使平滑肌收縮。His通過H1受體興奮而發(fā)揮作用，H1受體興奮可使支氣管平滑肌收縮，His參與哮喘有關(guān)的反應(yīng)大多由H1受體介導(dǎo)。ACh是M受體激動劑，它可以通過與G蛋白偶聯(lián)，致磷脂酶C活化，產(chǎn)生1，4-肌醇三磷酸，誘發(fā)儲存于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)中Ca2+的釋放，引起氣道平滑肌收縮，產(chǎn)生支氣管痙攣［14－15］。

本實驗結(jié)果顯示，佛司可林和異佛司可林對His、ACh刺激收縮下的離體氣管螺旋條有明顯的舒張作用，且隨著濃度的加大而有所增長，推測兩者均可能具有拮抗His、ACh的作用。比較其最大舒張幅度，在His組異佛司可林高于佛司可林，而在ACh組異佛司可林低于佛司可林;比較其解痙EC50，則異佛司可林均小于佛司可林。

佛司可林G、J、A、I這4個化合物對由His誘導(dǎo)引起的離體豚鼠氣管條收縮也均有明顯的舒張作用，亦隨著濃度的增加而有所增加，推測均可能具有拮抗His的作用。與異佛司可林、佛司可林相比較，最大舒張幅度由大到小依次為佛司可林J、異佛司可林、佛司可林A、佛司可林、佛司可林G、佛司可林I，EC50從大到小依次為佛司可林、異佛司可林、佛司可林J、佛司可林 G、佛司可林I、佛司可林 A(Fig 4)。以上6個化合物的平喘作用機(jī)制，有待進(jìn)一步研究。

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