舒銀銀，謝軍明，李永樂，張 瑤，劉清珍，劉 健，李偉彥

(1.南方醫(yī)科大學(xué)南京臨床醫(yī)學(xué)院，2.南京軍區(qū)南京總醫(yī)院麻醉科，江蘇 南 京 210002)

嗎啡是臨床廣泛應(yīng)用的強效鎮(zhèn)痛藥，但長期應(yīng)用嗎啡后其鎮(zhèn)痛作用逐漸減弱，即產(chǎn)生所謂的嗎啡耐受現(xiàn)象［1］。近年來多項研究提示膠質(zhì)細胞活化，尤其是脊髓小膠質(zhì)細胞及星形膠質(zhì)細胞的活化，與嗎啡耐受的發(fā)生密切相關(guān)。白細胞介素-18(IL-18)是IL-1的類似物，既往研究提示其介導(dǎo)了神經(jīng)病理性疼痛時小膠質(zhì)細胞與星形膠質(zhì)細胞的聯(lián)系［2］，據(jù)此我們推測其亦可能參與了嗎啡耐受的發(fā)生。本實驗采用特異性的IL-18中和抗體，阻斷脊髓IL-18信號傳導(dǎo)，探討其對大鼠嗎啡耐受形成的影響，并分析可能的作用機制，為防治嗎啡耐受提供新的思路和科學(xué)的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與分組 清潔級♂ SD大鼠，體質(zhì)量150～180 g(南京軍區(qū)南京總醫(yī)院比較醫(yī)學(xué)科提供)。鹽酸嗎啡注射液(沈陽第一制藥廠，中國)，PBS緩沖液(上海研拓生物科技有限公司，中國)，對照IgG(Normal Goat IgG Control，R＆D systems，美國)，羊抗大鼠IL-18中和抗體(Anti-rat IL-18 Antibody，R＆D systems，美國)。所有大鼠隨機分為5組，每組8只。Ⅰ組為生理鹽水對照組 ，Ⅱ組為嗎啡耐受組，Ⅲ組為IgG對照組，Ⅳ組、Ⅴ組為IL-18中和抗體(0.4、4 μg)處理組。

1.2 鞘內(nèi)置管模型建立 參照Cui等［3］方法，即大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉60 mg·kg－1麻醉后，以L5－6間隙為中心作一皮膚縱向切口，分離椎旁肌肉，暴露L5－6椎間隙，以稍鈍針頭穿破黃韌帶及硬脊膜，可見大鼠出現(xiàn)甩尾反射及清亮腦脊液外溢。置入并固定導(dǎo)管，經(jīng)皮下自頸部將其引出。置管5 d后，將2%利多卡因20 μl注入后肢無明顯運動障礙的大鼠鞘內(nèi)，若后肢麻痹拖地則建模成功，列入實驗組(記作第1天)。建模不成功大鼠予以麻醉處死。

1.3 給藥方案 參照 Raghavendra等［4］方法建立嗎啡耐受模型，即第3－9天，每日8:00－9:00與16:00－17:00，Ⅱ-Ⅴ組大鼠分別皮下注射嗎啡(10 mg·kg－1)一次，Ⅰ組為皮下注射等量生理鹽水。上午給予嗎啡前30 min，Ⅰ組、Ⅱ組鞘內(nèi)給予PBS緩沖液，Ⅲ、Ⅳ、Ⅴ組鞘內(nèi)分別給予 IgG 4 μg，IL-18中和抗體 0.4 μg、4 μg。鞘內(nèi)給藥均為 20 μl(IgG，IL-18中和抗體均采用PBS緩沖液溶解稀釋)。

1.4 行為學(xué)測試 第 2、10天，參照 Hargreaves等［5］方法，應(yīng)用足底輻射熱痛覺測試儀(Model 390，IITC Life ScienceInc，美國)，測定各組大鼠熱刺激縮足反應(yīng)潛伏期PWTL。每只大鼠重復(fù)測量5次，單次光照時間不超過20 s(cutoff time)，去掉最大及最小值，取平均值即為大鼠的基礎(chǔ)潛伏期。之后，尾靜脈注射嗎啡(4 mg·kg－1)，測定給予嗎啡后30 min的PWTL，取平均值即為大鼠給藥后潛伏期。計算30 min的最大可能鎮(zhèn)痛效應(yīng)比值%MPE(percentage of maximal possible antinociceptive effect)，%MPE=(給藥后潛伏期－基礎(chǔ)潛伏期)/(cutoff time－基礎(chǔ)潛伏期)×100%。

1.5 標本采集 第10天行為學(xué)測試結(jié)束后，大鼠腹腔注射2%戊巴比妥鈉80 mg·kg－1。取4只大鼠快速截取脊髓腰膨大于液氮中保存，留待Western blot法檢測蛋白表達。另取4只大鼠開胸灌注，留取腰膨大用于免疫熒光染色。

1.6 Western blot法檢測 ERK與p-ERK 蛋白表達 取脊髓腰膨大，組織勻漿離心取上清液，蛋白定量煮樣后，灌制10%SDS-PAGE凝膠，每孔上樣量50 μg(10 μl)，電泳，轉(zhuǎn)膜，5% 脫脂牛奶室溫封閉 1 h，一抗4℃孵育過夜，TBST洗5 min×6次，二抗室溫孵育1 h，TBST洗5 min×6次，Super Signal West Pico試劑盒顯色。內(nèi)參為GAPDH(1∶1 000，Cell Signaling Technology，美國)。免疫印跡條帶由UNSCAN-IT gel 6.1軟件分析。

1.7 免疫組織熒光染色 參照Cui等［6］等方法采用免疫熒光染色法，取腰5脊髓蔗糖溶液梯度脫水，連續(xù)冰凍切片，片厚20 μm。5%BSA封閉1h，GFAP抗體(1∶500，Santa Cruz Biotechnology)4℃孵育過夜，TBST洗3次，加入異硫氰酸熒光素標記的二抗(1∶300，Santa Cruz Biotechnology)室溫避光孵育2 h，漂洗3次。每個標本隨機抽取5張切片，激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察。

1.8 統(tǒng)計學(xué)分析 應(yīng)用SPSS 13.0統(tǒng)計軟件進行分析，計量資料以±s表示，組間比較采用單因素方差分析，其后兩兩組間比較采用Bonferroni檢驗。

Fig 1 Effect of intrathecal anti-rat IL-18 antibody treatment on morphine antinociception(n=8)

2 結(jié)果

2.1 MPE值 第2天:各組大鼠給予嗎啡后30 min%MPE差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。第10天:給予嗎啡30 min后，與Ⅰ組相比，其余4組%MPE均明顯降低(P＜0.05)。與Ⅱ組相比，Ⅲ組、Ⅳ組差異無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，Ⅴ組%MPE明顯升高(P＜0.05)。見Fig 1。

2.2 脊髓腰膨大ERK與p-ERK蛋白表達變化

Western blot結(jié)果顯示，5組大鼠腰段脊髓ERK表達量差異均無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)。與I組相比，其余各組p-ERK表達量均升高(P＜0.05)。與Ⅱ組相比，Ⅲ組、Ⅳ組p-ERK表達水平無統(tǒng)計學(xué)意義(P＞0.05)，Ⅴ組明顯降低(P＜0.05)。見Fig 2。

2.3 脊髓背角星形膠質(zhì)細胞標記物GFAP熒光表達變化 免疫組織熒光染色結(jié)果顯示，Ⅰ組大鼠腰段脊髓背角GFAP表達量較少。與Ⅰ組相比，Ⅱ組GFAP表達量明顯增加。與Ⅱ組相比，Ⅲ、Ⅳ組無明顯差異，Ⅴ組GFAP表達量明顯降低。見Fig 3。

Fig 2 Expression of ERK and p-ERK in the spinal cord lumbar enlargement(n=3)

Fig 3 Expression of GFAP in the dorsal horn of the spinal cord lumbar enlargement

3 討論

近年來，越來越多的研究證實，膠質(zhì)細胞活化，尤其是脊髓小膠質(zhì)細胞與星形膠質(zhì)細胞的活化，密切參與了嗎啡耐受的發(fā)生［7－10］。與神經(jīng)病理性疼痛研究結(jié)果相似，大量研究提示:抑制小膠質(zhì)細胞活化僅能預(yù)防嗎啡耐受的發(fā)生，卻不能緩解已存在的嗎啡耐受［3，6，11］。而膠質(zhì)細胞抑制劑丙戊茶堿則既能預(yù)防嗎啡耐受的發(fā)生，也能緩解已存在的嗎啡耐受［8］。據(jù)此推測嗎啡耐受可能是由脊髓小膠質(zhì)細胞的活化引起的，而星形膠質(zhì)細胞的持續(xù)活化則對嗎啡耐受起到了維持作用。

Miyoshi等［2］研究發(fā)現(xiàn)，L5 脊神經(jīng)結(jié)扎后脊髓小膠質(zhì)細胞表達IL-18明顯增加，而星形膠質(zhì)細胞表達的IL-18受體亦明顯增加;阻斷IL-18或IL-18受體信號，能明顯減輕神經(jīng)損傷誘導(dǎo)的觸覺過敏，并抑制星形膠質(zhì)細胞標志物GFAP的表達。IL-18介導(dǎo)的小膠質(zhì)細胞與星形膠質(zhì)細胞的相互作用，對于神經(jīng)損傷誘導(dǎo)的痛覺過敏的發(fā)生與維持起著重要作用。Mayer等［12］研究發(fā)現(xiàn)，嗎啡耐受和神經(jīng)病理性疼痛的發(fā)生發(fā)展有著相似的分子機制。結(jié)合神經(jīng)病理性疼痛研究的結(jié)果，我們推測:小膠質(zhì)細胞活化并釋放的IL-18，作用于星形膠質(zhì)細胞表面的IL-18受體，導(dǎo)致了星形膠質(zhì)細胞的活化，嗎啡耐受的維持。

本實驗我們采用Raghavendra等［4］方法建立慢性嗎啡耐受模型，第10天嗎啡耐受組較生理鹽水對照組%MAP明顯降低，提示嗎啡耐受已經(jīng)形成，嗎啡的鎮(zhèn)痛效能降低。與嗎啡耐受組相比，IL-18中和抗體4 μg處理組%MAP明顯升高，即嗎啡的鎮(zhèn)痛效能明顯改善，提示4 μg IL-18中和抗體與嗎啡聯(lián)合應(yīng)用，可部分緩解嗎啡耐受的形成。進一步的蛋白印跡和免疫熒光染色結(jié)果顯示，與生理鹽水組相比，嗎啡耐受組大鼠腰段脊髓背角星形膠質(zhì)細胞標志物GFAP的免疫活性以及p-ERK的表達均明顯增高;而鞘內(nèi)注射4 μg IL-18中和抗體能明顯降低GFAP和p-ERK的表達量。這提示阻斷脊髓IL-18，可抑制嗎啡誘導(dǎo)的脊髓星形膠質(zhì)細胞及ERK通路的活化。

綜上所述，給予IL-18中和抗體阻斷脊髓IL-18信號，可部分抑制嗎啡耐受的形成，該效應(yīng)可能與通過抑制嗎啡誘導(dǎo)的脊髓背角星形膠質(zhì)細胞的活化及ERK通路的激活有關(guān)。本研究提示，阻斷脊髓內(nèi)IL-18信號，有望為防治嗎啡耐受提供一條新的途徑。

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