鄭小麗，董憲喆，穆麗華，廖紅波，余冰穎，3，劉 屏

(1.解放軍總醫(yī)院臨床藥理研究室，北京 100853;2.天津中醫(yī)藥大學(xué)，天津 300193;3.河北北方學(xué)院，河北 張家口 075000)

目前，從紫金牛科(Myrsinaceae)紫金牛屬植物走馬胎(Ardisia gigantifoliaStapf.縮寫為AG)中提取分離得到的成分主要有:三萜皂苷類、巖白菜素衍生物類［1］、揮發(fā)油類等［2］。有研究發(fā)現(xiàn)［3］走馬胎中的巖白菜素類化合物具有抗氧化活性;張曉明等［4］對三萜皂苷類成分進行了抗腫瘤活性的篩選，發(fā)現(xiàn)三萜皂苷類化合物對多種腫瘤細胞都有一定的抗腫瘤活性，并初步研究了化合物之間的構(gòu)效關(guān)系，而且以西克拉敏A為母核以及C－3位連有糖鏈、C－16位－OH、C－13，28位環(huán)氧橋、C－30位－CHO 的三萜皂苷類化合物都有一定的抗腫瘤活性。

化合物AG4是從走馬胎干燥的根莖中提取分離得到的以西克拉敏A為母核的齊墩果烷型五環(huán)三萜皂苷，其化學(xué)名為:3β-O-{α-L-吡喃鼠李糖基－(1→3)－［β-D-吡喃木糖基－(1→2)］-β-D-吡喃葡萄糖基－(1→4)－［β-D-吡喃葡萄糖－(1→2)］－α-L-吡喃阿拉伯糖基}－西克拉敏A，化學(xué)結(jié)構(gòu)式見Fig 1。本實驗室前期的研究結(jié)果表明［5］，AG4對人胃癌細胞BGC-823、肝癌細胞 HepG2、膀胱癌細胞EJ及宮頸癌細胞HeLa有明顯的增殖抑制作用，但作用機制尚不明確。本文研究了AG4對MCF-7等9種不同的腫瘤細胞的細胞毒作用，進一步明確AG4的抑瘤譜，并從誘導(dǎo)凋亡、周期阻滯和氧化還原系統(tǒng)方面重點研究了其抑制MCF-7細胞增殖的作用機制以及誘導(dǎo)MCF-7細胞凋亡的線粒體信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路。

Fig 1 Structure of AG4

1 材料與方法

1.1 藥品與主要試劑 AG4由本研究室提供，純度0.99以上;RPMI 1640培養(yǎng)基(Gibco公司);DMEM/HIGH GLUCOSE培養(yǎng)基和胎牛血清(Hy-Clone公司);MTT(Solarbio公司);Annexin V-FITC凋亡試劑盒(碧云天公司);碘化丙啶(PI)和核糖核酸酶(Rnase A酶)(Sigma公司);蛋白質(zhì)定量試劑盒(Bradford法)、Caspase-3和Caspase-9活性檢測試劑盒(普利萊公司);微量還原型谷胱甘肽(GSH)測定試劑盒、超氧化物歧化酶(SOD)WST-1法測定試劑盒和微量丙二醛(MDA)測定試劑盒(南京建成公司)。

1.2 細胞株 人肺癌細胞A549、人肝癌細胞Bel-7402、人胃腺癌細胞BGC-823、人膀胱癌細胞EJ、人宮頸癌細胞HeLa、人肝癌細胞HepG2、人乳腺癌細胞MCF-7、人結(jié)腸腺癌細胞LS180均由中國醫(yī)學(xué)科學(xué)院藥用植物研究所藥理毒理研究中心畢明剛研究員惠贈，由本實驗室復(fù)蘇、傳代、培養(yǎng)。大鼠膠質(zhì)瘤細胞C6由301醫(yī)院腫瘤中心提供，由本實驗室復(fù)蘇、傳代、培養(yǎng)。

1.3 儀器 全波長微孔板光度計(Dynex，美國);二氧化碳培養(yǎng)箱(MCO-15AC，SANYO，日本);熒光倒置生物顯微鏡(IX51，OLYMPUS，日本);低速離心機(DT5-2，北京時代北利離心機有限公司);流式細胞儀(FCM，F(xiàn)ACS Calibur，BD，美國);紫外分光光度計(2800 UV/VIS，UNICO，美國)。

1.4 方法

1.4.1 細胞培養(yǎng) 細胞置于含體積分數(shù)為10%的胎牛血清的 RPMI 1640培養(yǎng)基中，在 37℃，5%CO2，飽和濕度的條件下培養(yǎng)，其中C6和MCF-7細胞用DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)。2 d換液1次，細胞生長至70%－80%融合時傳代。

1.4.2 MTT法檢測AG4的體外抗腫瘤細胞增殖活性 取對數(shù)生長期細胞消化成單細胞懸液，調(diào)整細胞密度至5 ×107·L－1，以每孔 90 μl接種于 96 孔板內(nèi)培養(yǎng)24 h。各組分別加入含有終濃度分別為0、0.51、1.02、2.03、4.06 和8.13 μmol·L－1AG4 的培養(yǎng)基，每組設(shè)置5個復(fù)孔。細胞分別繼續(xù)培養(yǎng)24、48 和 72 h，加入終濃度為 5 g·L－1的 MTT，4 h后棄去培養(yǎng)液，每孔加入150 μl DMSO，振蕩溶解10 min，在490 nm處檢測光密度值(OD)。根據(jù)以下公式計算細胞抑制率(%):細胞抑制率/%=1－［(OD受試藥組－OD空白組)/(OD正常組 –OD空白組)］×100%，采用Excel軟件對抑制率和濃度數(shù)據(jù)作相關(guān)性分析，并采用曲線回歸法計算半數(shù)抑制濃度(IC50)值。

1.4.3 AG4對MCF-7細胞形態(tài)的影響 將處于對數(shù)生長期的細胞消化成單細胞懸液，以1×108·L－1并接種于 12 孔板中，每孔 500 μl，培養(yǎng) 24 h 后，更換成等體積的含有終濃度分別為0、2.03、4.06和8.13 μmol·L－1AG4 培養(yǎng)基，繼續(xù)常規(guī)培養(yǎng) 24 h。然后向每孔加入500 μl稀釋好的Hoechst染色液，37℃培養(yǎng)30 min后于熒光顯微鏡下觀察細胞形態(tài)并采集照片。

1.4.4 流式細胞儀(FCM)檢測細胞凋亡 將對數(shù)生長期的MCF-7細胞以1×109·L－1的密度接種于6孔板中，每孔1 ml，培養(yǎng)24 h，更換成等體積的含有終濃度分別為0、2.03、4.06 和8.13 μmol·L－1AG4 培養(yǎng)基，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，收集細胞。預(yù)冷的PBS輕輕重懸細胞兩次，離心收集細胞。向各細胞沉淀中加入195 μl的Annexin V-FITC結(jié)合液重懸細胞，加入5 μl的Annexin V-FITC，輕輕混勻避光，室溫孵育10 min。1 000×g離心5 min，吸除溶液，加入 190 μl的 Annexin V-FITC結(jié)合液，重懸細胞，加入10 μl碘化丙啶(PI)染色液，輕輕混勻，流式細胞儀檢測。

1.4.5 檢測 Caspase-3、Caspase-9的活性 細胞處理方法同“1.4.4”。向各組細胞沉淀中加入等量裂解液，冰上孵育10 min，離心收集上清，采用Bradford法進行蛋白定量，并根據(jù)試劑盒說明書進行Caspase-3和Caspase-9的活性測定。

1.4.6 流式細胞儀檢測細胞周期 細胞處理方法同“1.4.4”。細胞沉淀用70%的乙醇于－20℃固定過夜。離心收集細胞，100 μl RNase A(1 g·L－1)懸浮細胞，37℃恒溫金屬浴中孵育30 min后加入400 μl PI(50 mg·L－1)，4℃避光孵育30 min，F(xiàn)CM 檢測細胞周期。

1.4.7 AG4對MCF-7細胞內(nèi)GSH、SOD和MDA含量的影響 細胞處理方法同“1.4.4”。向各組細胞沉淀中加入等量裂解液，冰上孵育10 min，離心收集上清，采用Bradford法進行蛋白定量，并根據(jù)GSH、SOD和MDA的說明書進行含量測定。

Tab 1IC50of AG4 on different tumor cell lines in vitro at different time(±s，n=3)

Tab 1IC50of AG4 on different tumor cell lines in vitro at different time(±s，n=3)

Time/h IC50/μmol·L －1 A549 BGC Bel-7402 C6 MCF-7 EJ HeLa HepG2 LS180 24 4.59 ±0.50 4.70 ±0.14 5.12 ±0.12 6.31 ±0.98 3.67 ±0.61 6.25 ±0.09 5.32 ±0.38 5.63 ±0.59 6.21±1.59 48 4.25 ±0.19 5.38 ±0.45 5.91 ±1.07 5.73 ±0.57 3.76 ±0.66 6.07 ±1.32 5.70 ±0.44 5.39 ±0.69 7.56 ±0.97 72 4.51 ±0.46 4.37 ±0.38 5.79 ±0.88 4.59 ±0.66 4.03 ±0.47 11.58 ±0.66 5.97 ±0.02 6.45 ±0.51 7.27 ±0.88

2 結(jié)果

2.1 AG4對腫瘤細胞株的增殖抑制作用 不同濃度的 AG4(0.51 ～8.13 μmol·L－1)對9 種腫瘤細胞株的增殖均有一定的抑制作用，其中MCF-7細胞株對AG4相對敏感，24、48和72 h的 IC50值分別為(3.67±0.61)、(3.76±0.66)和(4.03±0.47)μmol·L－1;AG4 在 0.51 ～8.13 μmol·L－1濃度范圍內(nèi)對MCF-7細胞的增殖抑制作用具有濃度依賴性。見Tab 1和Fig 2。

Fig 2 Antiproliferation activity of AG4 on MCF-7 cell in vitro

2.2 AG4對MCF-7細胞株形態(tài)的影響 正常組細胞形態(tài)規(guī)則，輪廓清晰，呈多角形貼壁生長，細胞核被均勻的染成藍色。8.13 μmol·L－1的 AG4作用于細胞后，細胞單個散在，細胞間距明顯變大，并且大部分細胞濃染，呈高亮度藍色熒光。4.06 μmol·L－1濃度組部分染色質(zhì)凝集的細胞發(fā)現(xiàn)藍色熒光。2.03 μmol·L－1的 AG4 對 MCF-7 細胞的細胞形態(tài)基本沒有影響。見Fig 3。

2.3 AG4對 MCF-7細胞株凋亡的影響 4.06、8.13 μmol·L－1的 AG4 處理 MCF-7 細胞 24 h 后，細胞可見早期凋亡，凋亡率分別為18.28% ±5.40%、50.86% ±9.4%，對照組凋亡率為1.83%±0.20%。4.06 和 8.13 μmol·L－1組與對照組相比差異有顯著性(P＜0.01)，2.03 μmol·L－1組與對照組相比差異無顯著性(P＞0.05)，見Fig 4。

2.4 AG4對MCF-7細胞內(nèi)Caspase-3和Caspase-9蛋白表達的影響 8.13、4.06以及2.03 μmol·L－1組，Caspase-3的活性均有提高，與正常對照組相比都有差異;8.13、4.06 μmol·L－1兩組 Caspase-9的活性有明顯的提高，并且兩酶活性的增加都有濃度依賴性。見Tab 2。

2.5 AG4對敏感細胞周期時相的影響 實驗結(jié)果表明，正常組細胞多分布于G1期，約占總細胞數(shù)的56%，S期和 G2/M期各占約24%和19%;4.06 μmol·L－1的 AG4作用 MCF-7 細胞24 h后，S期細胞明顯增加，G2/M期細胞明顯減少，與正常對照組相比差異有顯著性(P＜0.01);2.03 μmol·L－1的AG4處理組也表現(xiàn)出S期細胞增加，G2/M期細胞減少的趨勢，但與正常組相比差異無顯著性。見Fig 5和 Tab 3。

Fig 3 Morphology of MCF-7 cells treated with different doses of AG4 for 24h(100×)

Tab 2 Influence of various concentrations of AG4 on activities of Caspase-3 and Caspase-9 of MCF-7 cells for 24h(±s，n=3)

Tab 2 Influence of various concentrations of AG4 on activities of Caspase-3 and Caspase-9 of MCF-7 cells for 24h(±s，n=3)

*P＜0.05，＊＊P＜0.01 vs control

Group/μmol·L －1 Concentration/kU·g－1Pro Caspase-3 Caspase-9 Control 7.72 ±1.51 2.80 ±1.04 2.03 15.29 ±0.24* 8.81 ±0.63 4.06 31.45 ±3.95＊＊ 17.95 ±2.78＊＊8.13 46.22 ±4.96＊＊ 26.98 ±5.12＊＊

Fig 4 The apoptotic rate of MCF-7 cells treated with different doses of AG4 for 24h

Fig 5 Effects of various concentrations AG4 treatment for 24h on the MCF-7 cell cycle

Tab 3 Effects of various concentrations of AG4 treatment for 24h on MCF-7 cell cycle

2.6 AG4對MCF-7細胞內(nèi)SOD的活性、GSH和MDA 含量的影響 8.13、4.06 μmol·L－1的 AG4分別作用于MCF-7細胞24 h后，細胞內(nèi)SOD的活性和GSH的含量與正常對照組相比明顯降低，MDA的含量明顯升高(P＜0.01)。而2.03 μmol·L－1組，SOD、GSH和MDA與正常組相比均沒有明顯變化。

Tab 4 Effect of AG4 on activities of SOD，GSH and MDA content of MCF-7 cells

3 討論

研究表明，走馬胎所含的皂苷成分，特別是以西克拉敏A為母核的三萜皂苷類化合物有明顯的抗腫瘤活性。本實驗室從走馬胎中分離得到多個以西克拉敏A為母核的皂苷類化合物，其中的單體AG4表現(xiàn)出較強的體外抑制腫瘤細胞增殖的作用。本文在課題組前期工作的基礎(chǔ)上，研究了AG4對A549、Bel-7402等9種腫瘤細胞的增殖抑制作用。發(fā)現(xiàn)AG4對這9種腫瘤細胞的增殖均有明顯的抑制作用，對不同類型的瘤株沒有明顯的選擇性，其對細胞的增殖抑制作用表現(xiàn)出明顯的濃度依賴性，但在72 h沒有時間依賴性。這種現(xiàn)象可能與其本身的結(jié)構(gòu)特征、化學(xué)性質(zhì)和作用機制有關(guān)，尚待進一步研究。

大多數(shù)藥物通過誘導(dǎo)腫瘤細胞凋亡達到抗腫瘤的目的，而形態(tài)學(xué)變化是判斷細胞凋亡的基礎(chǔ)。Hoechst染色實驗及Annexin V-FITC/PI雙染實驗結(jié)果均證實，細胞出現(xiàn)了明顯的凋亡現(xiàn)象。在細胞凋亡早期，線粒體膜通透性轉(zhuǎn)換孔(PTP)開放，若PTP大量或長時間開放，出現(xiàn)明顯的基質(zhì)腫脹，最終引起外膜的破裂，導(dǎo)致線粒體不可逆的損傷，從而釋放細胞色素C等，繼而激活Caspase級別反應(yīng)啟動細胞凋亡［6］。其中，Caspase-3是 Caspase級聯(lián)反應(yīng)中最末端的效應(yīng)蛋白酶，其上游的Caspase-9是線粒體凋亡通路中的關(guān)鍵酶［7］。本研究中，AG4能夠使MCF-7細胞中Caspase-3和Caspase-9的活性增加，明顯高于正常對照組。據(jù)此可初步推斷，AG4可能是通過影響線粒體功能，激活線粒體凋亡途徑誘導(dǎo)MCF-7細胞凋亡。

活性氧(reactive oxygen species，ROS)主要在線粒體內(nèi)產(chǎn)生，高于生理水平的ROS導(dǎo)致線粒體功能降低。細胞過氧化損傷時會生成脂質(zhì)過氧化物MDA，同時，細胞內(nèi)的抗氧化酶SOD及低分子清除劑GSH等會積極清除ROS以維持細胞內(nèi)氧化還原的平衡。本文研究結(jié)果顯示，AG4明顯增加MCF-7細胞內(nèi)的MDA含量;降低GSH含量和SOD的活性?？梢夾G4能明顯降低MCF-7細胞抗氧化能力，導(dǎo)致不能維持細胞內(nèi)氧化還原的平衡，與線粒體功能損傷共同誘導(dǎo)細胞凋亡。

細胞內(nèi)的氧化還原系統(tǒng)處于動態(tài)平衡狀態(tài)，平衡的波動可能會引起細胞周期的調(diào)整［8］，而細胞周期調(diào)控過程是控制細胞周期事件的精密調(diào)控網(wǎng)絡(luò)，腫瘤細胞增殖活躍，其周期比正常細胞的短，因此，許多抗腫瘤藥物通過阻滯腫瘤細胞的細胞周期來實現(xiàn)對腫瘤細胞選擇性的目的。本研究發(fā)現(xiàn)4.06 μmol·L－1的 AG4作用細胞24 h后，MCF-7細胞處于S期的細胞比例明顯高于正常對照組，幾乎沒有細胞處于G2/M期;結(jié)合細胞增殖抑制實驗及細胞凋亡實驗結(jié)果，可推斷，4.06 μmol·L－1的 AG4 作為凋亡誘導(dǎo)因素，作用于MCF-7細胞后，導(dǎo)致細胞DNA損傷，損傷信號激活檢測點蛋白，將細胞阻滯在S期并招募特定的酶對細胞進行修復(fù);修復(fù)好的細胞將繼續(xù)進入下一期，同時啟動凋亡途徑誘導(dǎo)無法修復(fù)的細胞凋亡。而2.03 μmol·L－1濃度組的細胞能通過S期檢測點的檢測，從而進入G2/M期，可能是由于2.03 μmol·L－1的 AG4 對 MCF-7 細胞造成的損傷程度較輕，易于修復(fù)，同時也說明AG4對MCF-7細胞的周期影響具有濃度依賴性。

綜上所述，走馬胎中皂苷成分AG4對多種腫瘤細胞的增殖都有一定的抑制作用。其對人乳腺癌細胞MCF-7的抑制作用，可能是因其破壞細胞內(nèi)氧化還原系統(tǒng)的動態(tài)平衡，導(dǎo)致細胞代謝產(chǎn)生的ROS增加，而高水平的ROS引起了細胞的DNA損傷，導(dǎo)致DNA不能正常復(fù)制，被阻滯在S期，最終啟動凋亡程序。另外，AG4對Caspase-3和Caspase-9表達的影響，也提示其可能通過啟動線粒體凋亡信號轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑誘導(dǎo)細胞凋亡，而這一信號通路的啟動可能與細胞內(nèi)高水平的ROS損傷線粒體功能有關(guān)，具體機制尚需進一步研究。

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