任曉芬，潘道東，曹錦軒，曾小群

（寧波大學(xué)海洋學(xué)院，浙江寧波315211）

據(jù)專家預(yù)測，20年后全世界將會有超過15億人罹患高血壓，罹患人數(shù)比2000年增加60%。中國作為世界上高血壓危害最嚴重的國家之一，最近幾年全國每年新增六百多萬名高血壓患者。目前治療高血壓的藥物大多數(shù)是化學(xué)合成的ACE抑制劑類藥物，長期服用降壓藥將會嚴重地損害心、腦、肝、腎等重要的人體器官，并加劇并發(fā)癥的發(fā)生，最終危及人的生命。而通過攝入食源性ACE抑制物質(zhì)，不僅可以達到預(yù)防、控制和緩解高血壓的效果，而且相對于合成的降壓藥更安全可靠且無副作用，因此對于食源性ACE抑制物質(zhì)的研究必然成為今后的發(fā)展趨勢。近年來，研究發(fā)現(xiàn)一些乳酸菌制作的發(fā)酵乳制品具有較強的降高血壓功能，主要是由于乳酸菌在發(fā)酵過程中分泌的蛋白酶水解乳蛋白產(chǎn)生多肽，對血管緊張素轉(zhuǎn)移酶（angiotensin I-converting enzyme）具有抑制作用，從而達到降血壓的效果[1-3]。而酪蛋白作為乳蛋白的主要組成部分，可以通過酪蛋白水解產(chǎn)生ACE抑制肽，如Jeanette Otte等[4]從β-酪蛋白的水解物中分離鑒定出三種ACE抑制肽，它們分別源于β-酪蛋白A2的f58-76、f59-76及f192-196片段；潘道東等[5]從Lactobacillus helveticus JCM 1004酪蛋白水解產(chǎn)物中分離純化出Ile-Pro-Pro和Val-Pro-Pro兩種ACE抑制肽。胞壁蛋白酶（Cell-envelope Proteinase，CEP）作為乳酸菌蛋白水解系統(tǒng)中一種重要的酶，遇到乳蛋白時[6]，首先將乳蛋白水解為一系列的短肽，再由寡肽轉(zhuǎn)移系統(tǒng)（Opp）、二肽和三肽轉(zhuǎn)運系統(tǒng)（DtpP和DtpT）運輸至細胞內(nèi)，最后由胞內(nèi)肽酶（包括氨肽酶、肽鏈內(nèi)切酶、pro-特異性肽酶等）將短肽進一步水解成具有降血壓作用的ACE抑制肽。由于ACE抑制肽是在蛋白水解過程中產(chǎn)生，但是其具體的水解機制尚不成熟，因此對于CEP的研究就至關(guān)重要。根據(jù)不同的菌體特性所選擇的破壁方法也不同，目前可用于提取CEP的方法主要有3種[7-9]：Ca2+-free法、溶菌酶法和超聲波破碎法。由于采用Ca2+-free法提取出的蛋白酶只是暴露在細胞壁外的N-端序列，因此提取率不高[8]；而超聲波破碎法由于其功率不穩(wěn)定、破碎強度較大，且會帶入大量的胞內(nèi)酶，因此不利于后期的分離純化。本實驗采用溶菌酶結(jié)合非離子表面活性劑法提取CEP，并對粗提物進行分離純化，不僅具有方法簡便、實驗條件易控制、提取率高等優(yōu)點，而且可以為研究乳酸菌蛋白酶水解機制建立基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

嗜酸乳桿菌JQ-1 實驗室篩選保藏菌株；溶菌酶 北京普博欣生物科技有限責(zé)任公司；MeOsuc-Arg-Pro-Tyr-pNA（MS-Arg） 上海生工生物工程公司；考馬斯亮藍G-250 南京賽吉科技有限公司；聚乙二醇（PEG）-20000 國藥集團化學(xué)試劑有限公司；DEAE-Sephadex A-25、Sephadex G-100 上海博蘊生物科技有限公司；馬尿酰-組氨酸-亮氨酸（Hippuryl-l-histidyl-l-leucine，HHL）、血管緊張素轉(zhuǎn)化酶（ACE）、β-酪蛋白 Sigma公司；MRS培養(yǎng)基。

可見光分光光度計 北京普析通用儀器有限責(zé)任公司；實驗室pH計 梅特勒-托利多儀器（上海）有限公司；恒溫恒濕培養(yǎng)箱 寧波江南儀器廠；H 2500R-2型湘儀離心機、H-2050R型臺式高速冷凍離心機 湘儀離心機儀器有限公司；分離層析裝置 上海滬西分析儀器廠有限公司；垂直電泳儀 北京市六一儀器廠；DB-2型電熱板 常州國華電器有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 菌體的制備 嗜酸乳桿菌菌體JQ-1采用50%甘油保藏（-40℃冷藏），連續(xù)活化三代，取3%接種量至新配制的MRS培養(yǎng)基中，37℃下擴大培養(yǎng)16h后取出，離心收集菌體沉淀（4500r/min，20min，4℃）。用含有Ca2+（30mmol/L）的Tris-HCl（50mmol/L，pH7.8）緩沖液洗滌菌體，于4500r/min，4℃下離心20min，棄上清液，重復(fù)洗滌三次，收集菌體，冷凍干燥后備用。

1.2.2 胞壁蛋白酶提取 取菌體2g，用裂解液（2mmol/L EDTA-Na2、100mmol/L NaCl、50mmol/L Tris-HCl、體積分數(shù)0.5%Triton X-100、1mg/mL溶菌酶，pH8.5）40mL懸浮菌體，37℃下保溫3h，于4℃、4500r/min離心20min，所得上清液即為粗酶液。根據(jù)溫度、時間及菌粉與裂解液比例單因素實驗結(jié)果，選取適當(dāng)條件進行正交實驗設(shè)計L9（34）優(yōu)化。

表1 L9（34）正交實驗因素水平表Table 1Factors and levels of orthogonal test table L9（34）

1.2.3 CEP酶活力測定[10]取20μL底物MeOsuc-Arg-Pro-Tyr-pNA（MS-Arg）（16.4mmol/L），40μL酶液，1.14mL Tris-HCl緩沖液（50mmol/L，pH7.0）混合，在37℃保溫60min。用0.5mL乙酸（體積分數(shù)30%）終止反應(yīng)，在410nm處測定吸光度（測定時需補充2.3mL蒸餾水）?？瞻讓φ战M，以蒸餾水代替酶液同樣條件操作。

酶活力單位定義：37℃，每小時A410nm增加0.10定義為一個酶活力單位（U/mL）。

酶比活力（U/mg）=酶活力/蛋白含量

1.2.4 蛋白含量測定[11]取1mL樣品、5mL蛋白試劑（將100mg考馬斯亮藍G-250溶于50mL 95%的乙醇中，再加入100mL 85%的磷酸，用雙蒸水補至1000mL），充分振蕩均勻，2min后于595nm波長處測定吸光度值，以雙蒸水作為空白對照組。以牛血清蛋白作為測定蛋白含量的標準樣品。

1.2.5 ACE抑制活性檢測方法[12]取200μL Hip-His-Leu（6.7mmol/L）溶液和100μL的樣品（即蛋白酶CEP水解β-酪蛋白的產(chǎn)物）混合，于37℃下保溫3min。再加入20μL ACE（0.1U/mL）溶液，充分混勻后在37℃下保溫30min。加入250μL的1.0N鹽酸溶液使反應(yīng)終止，然后加入1.7mL醋酸乙酯，經(jīng)15s振蕩混勻，吸取1.0mL的醋酸乙酯層于小燒杯中，置100℃的恒溫加熱板上蒸干。將其重新溶于1mL的去離子水中，在228nm波長處測定吸光度值。

式中，A為含樣品時，ACE和底物H-H-L反應(yīng)的吸光度值；B為用蒸餾水代替樣品時，ACE和底物HH-L反應(yīng)的吸光度值，即對照組。

1.2.6 嗜酸乳桿菌胞壁蛋白粗酶液濃縮 采用聚乙二醇濃縮法，將粗酶液裝入半透膜的袋里，截留分子量為3400u，外加聚乙二醇-20000覆蓋，并置于溫度為4℃的冰箱中，待濃縮至一定體積后取出。

1.2.7 DEAE-Sephadex A-25層析 DEAE-Sephadex A-25填料經(jīng)預(yù)處理后裝柱（φ2.6cm×40cm），用50mmol/L Tris-HCl（pH7.0）緩沖液充分平衡，上樣量為3mL，流速為40mL/h，采用50mmol/L Tris-HCl（pH7.0），0～0.1mol/L NaCl洗脫液進行線性梯度洗脫，收集A280nm處的洗脫峰測定酶活力及蛋白含量。收集酶活最高的洗脫峰以備下一步層析用。

1.2.8 Sephadex G-100層析 Sephadex G-100填料經(jīng)預(yù)處理后裝柱（φ1.6cm×50cm），用50mmol/L Tris-HCl（pH8.3）緩沖液充分平衡，上樣量為2mL，流速為20mL/h，采用50mmol/L Tris-HCl（pH8.3）洗脫液進行洗脫，收集A280nm處的洗脫峰測定酶活力及蛋白含量。

1.2.9 回收率及提純倍數(shù)計算 在酶的分離純化過程中，每完成一個關(guān)鍵的實驗步驟，均需測定酶的總活力及比活力，以監(jiān)視酶的去向。通過總活力的回收率及酶的提純倍數(shù)可判斷分離純化方法的優(yōu)劣及提純效果。

回收率（%）=（純化后的酶活力/粗酶液的酶活力）×100

純化倍數(shù)=純化后的酶比活力/粗酶液的酶比活力

1.2.10 蛋白酶分子量鑒定 蛋白酶分子量測定采用SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳[13-14]。

2 結(jié)果與分析

2.1 CEP提取條件的優(yōu)化

2.1.1 菌體與裂解液比例的確定 由圖1可知，在菌體與裂解液比例為1∶10（g/mL）時，CEP的酶活、酶比活最高，之后隨著菌體與裂解液比例的增大，CEP的酶活、酶比活均逐漸降低。溶菌酶作為裂解液中的關(guān)鍵成分，主要通過破壞細胞壁中的N-乙酰胞壁酸和N-乙酰氨基葡糖之間的β-1，4糖苷鍵，使細胞壁不溶性黏多糖分解成可溶性糖肽，導(dǎo)致細胞壁破裂內(nèi)容物逸出而使細菌溶解。隨著菌體與裂解液比例的增大，體系中的溶菌酶過多，可能發(fā)生結(jié)合，反而降低了裂解效果，使酶活、酶比活隨之降低。

圖1 菌體與裂解液的比例對CEP提取的影響Fig.1 Effect of thallus/cell lysis solution ratio on the extraction of cell-envelope proteinase

2.1.2 保溫時間的確定 由圖2可知，隨著保溫時間的增加，CEP蛋白酶活和蛋白酶比活均逐漸增大；當(dāng)保溫時間至3.5h時，酶活、酶比活力均達到最大值；隨著保溫時間的繼續(xù)增加，蛋白酶活、酶比活反而逐漸下降。這是由于當(dāng)時間小于3.5h時，裂解液尚未完全破壞菌體細胞壁，所以酶活逐漸上升；當(dāng)時間超過3.5h時，由于隨著乳酸發(fā)酵的進行，蛋白酶的作用加劇，提高了嗜酸乳桿菌蛋白酶對蛋白質(zhì)的分解能力[15]，底物濃度的降低和產(chǎn)物濃度的增高致使逆反應(yīng)加強，因此酶活降低。

圖2 保溫時間對CEP提取的影響Fig.2 Effect of incubation time on the extraction of cell-envelope proteinase

2.1.3 保溫溫度的確定 由圖3可知，隨著溫度的上升，酶活力和酶比活力都呈增大趨勢，當(dāng)保溫溫度為37℃時，酶活力和酶比活力都達到最大值，隨后酶活力和酶比活都會隨著溫度的上升而逐漸下降。這是由于低溫、高溫都偏離酶的最適溫度，低溫會降低酶反應(yīng)的速度，而高溫不僅會降低酶反應(yīng)的速度，甚至?xí)姑甘Щ?，因此低溫、高溫均不利于酶的提取?/p>

圖3 保溫溫度對CEP提取的影響Fig.3 Effect of incubation temperature on the extraction of cell-envelope proteinase

2.1.4 提取條件正交實驗的優(yōu)化 在單因素實驗結(jié)果基礎(chǔ)上，確定了提取條件正交實驗的幾種考察因素及水平，以酶比活力（酶比活力=酶活力/蛋白含量）為指標，結(jié)果見表2。

表2 提取條件正交實驗結(jié)果Table 2 Arrangement and experimental results of the orthogonal array design for optimizing three extraction conditions

從表3的極差可以看出，A、B、C三個因素中，A因素對酶比活力的影響是最顯著的，且各個因素影響CEP提取的大小順序為：菌體與裂解液的比例＞保溫時間＞保溫溫度，這反映出菌體與裂解液比例是CEP提取最關(guān)鍵的一個因素，保溫時間、保溫溫度兩因素的影響相對小一些。通過極差分析得出酶活力最優(yōu)水平組合是A1B3C1，而9個實驗組中最佳組合為A1B1C1，經(jīng)驗證實驗可得，A1B3C1條件下酶比活可達11.629U/mg，效果更好。因此可確定嗜酸乳桿菌CEP的最佳提取條件為：菌體與裂解液的比例1∶5（g/mL）、保溫溫度33℃、保溫時間4.0h，在該條件下所得酶比活力為11.629U/mg。

表3 提取條件優(yōu)化的正交實驗的極差分析結(jié)果Table 3 Analysis of orthogonal test of optimizing three extraction conditions

2.2 DEAE-Sephadex A-25離子交換層析

將粗酶液用聚乙二醇-20000濃縮，取濃縮酶液3mL上樣。經(jīng)DEAE-Sephadex A-25離子交換層析后有六個組分，收集每個組分測其蛋白酶活性（表4，圖4），發(fā)現(xiàn)第一組分蛋白酶活性最高，SDS-PAGE電泳檢測第一組分為一條帶（圖5）。

表4 DEAE Sephadex A-25各洗脫峰酶活分布Table 4 The activity of CEP of DEAE Sephadex A-25

圖4 DEAE-Sephadex A-25離子交換層析圖譜Fig.4 DEAE-Sephadex A-25 chromatography of crude CEP obtained by ammonium sulfate precipitation

2.3 Sephadex G-100層析

收集DEAE-Sephadex A-25第一組分，經(jīng)聚乙二醇-20000濃縮后上樣，上樣量為2mL，發(fā)現(xiàn)Sephadex G-100層析后只有一個組分（圖5），檢測該組分蛋白酶活力為9.069U。SDS-PAGE電泳檢測為一條帶（圖5），且與DEAE-Sephadex A-25第一組分的電泳條帶一致。經(jīng)SDS-PAGE電泳測定CEP為單體結(jié)構(gòu)，分子量約為45ku。蛋白酶經(jīng)Sephadex G-100純化后，比活力達到27.055U/mg，提純倍數(shù)達到50.951倍，最后回收率為12.569%（表5）。

圖5 細胞壁蛋白酶的SDS-PAGE圖譜Fig.5 SDS-PAGE of CEP

表5 胞壁蛋白酶純化過程Table 5 Data of purification procedure of CEP

2.4 ACE抑制活性檢測

將β-酪蛋白用50mmol/L Tris-HCl（pH 7.0）緩沖液配成2mg/mL的溶液，分別200μL作為底物，加入2mg/mL純化后CEP 40μL，于37℃中保溫4h，在100℃中加熱5min滅酶，經(jīng)測定發(fā)現(xiàn)水解液具有ACE抑制活性，且ACE抑制活性達48%。

圖6 Sephadex G-100層析圖譜Fig.6 Sephadex G-100 chromatography of fraction 1 obtained from DEAE-Sephadex A-25 chromatography

3 結(jié)論

本實驗確定了溶菌酶結(jié)合非離子表面活性劑法提取嗜酸乳桿菌JQ-1中CEP的最佳條件：菌體與裂解液比例為1∶5（g/mL），33℃下保溫4.0h，于4℃、4500r/min離心20min后取上清液即為粗酶液。此法簡便，實驗條件易控制，酶活力也較高。粗酶液經(jīng)聚乙二醇-20000濃縮，DEAE-Sephadex A-25和Sephadex G-100兩步柱層析分離純化后，蛋白酶提純倍數(shù)達50.951倍，最后回收率為12.569%。且SDS-PAGE檢測蛋白酶為單體結(jié)構(gòu)，分子量大約為45ku。用純化后的CEP水解β-酪蛋白，水解液ACE抑制率達48%。由此說明，胞壁蛋白酶在嗜酸乳桿菌水解酪蛋白產(chǎn)生ACE抑制肽過程中起關(guān)鍵作用，但是其水解機制還有待于進一步研究。

[1]Sadat-Mekmene L，Genay M，Atlan D，et al.Original features of cell-envelope proteinases of Lactobacillus helveticus.A review[J].International Journal of Food Microbiology，2011，146：1-13.

[2]H’ebert E M，Raya1 R R，De Giori1 G S.Characterisation of a cell-envelope proteinase from Lactobacillus Helveticus[J].Biotechnology Letters，1999（21）：831-834.

[3]霍建新.瑞士乳桿菌發(fā)酵乳蛋白肽與抗ACE功能的研究[D].天津：天津科技大學(xué)，2007.

[4]Otte J，Shalaby S，Zakora M，et al.Fractionation and identification of ACE-inhibitory peptides fromα-lactalbumin and β-casein produced by thermolysin-catalysed hydrolysis[J].International Dairy Journal，2007（17）：1460-1472.

[5]Pan D D，Luo Y M，Tanokura.Antihypertensive peptides from skimmed milk hydrolysate digested by cell-free extract of Lactobacillus helveticus JCM1004[J].Food Chemistry，2005，91：123-129.

[6]LAW J，Haandrikman A.Proteolytic enzymes of lactic acid bacteria[J].International Dairy Journal，1997（7）：1-11.

[7]Palencia de FernAndez P，Pehiez C，Requena T，et al.Release and partial characterization of cell-envelope proteinases from Lactococcus lactis subsp，lactis IFPL 359 and Lactobacillus casei subsp.casei IFPL 731 isolated from raw goat’s-milk cheese[J].Z Lebensm Unters Forsch，1995，201：87-90.

[8]MARTIN-HERNANDEZ M C，ALTING A C，EXTERKATE F A.Purification and characterization ofthe cell-envelope proteinase of Lactobacillus helveticus L89[J].Applied Microbiology Biotechnology，1994，40：828-834.

[9]郭宇星，潘道東.瑞士乳桿菌細胞壁蛋白酶提取研究[J].食品科學(xué)，2007，28（10）：421-424.

[10]Yamamoto N，Akino A，Takano T.Purification and specificity of a cell-wall-associated proteinase from Lactobacillus helveticus CP790[J].J Biochem，1993，114：740-744.

[11]潘道東，童敏，吳振.干酪乳桿菌胞壁蛋白酶提取條件優(yōu)化及其水解特性研究[J].中國食品學(xué)報，2011，11（7）：102-109.

[12]Raghavan S，Kristinsson G.ACE-inhibitory activity of tilapia protein hydrolysates[J].Food Chemistry，2009，117：582-588.

[13]王憲澤.生物化學(xué)實驗技術(shù)原理和方法[M].北京：中國農(nóng)業(yè)出版社，2002.

[14]Guo Y X，Pan D D，Zeng X Q，et al.Purification and characterization of CEP from Lactococcus lactis ssp.Lactis[J].Food Chemistry，2009，112：533-538.

[15]趙瑞香.嗜酸乳桿菌及其應(yīng)用研究[M].北京：科學(xué)出版社，2007：172-177.