劉 麗，吳 青，林鳳英，鄺敏華

（華南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品學(xué)院，廣東省食品質(zhì)量安全重點實驗室，廣州天河510642）

食用合成色素是以改善食品色澤為目的的重要食品添加劑，在食品加工中被廣泛使用。國標(biāo)GB2760-2011規(guī)定食用合成色素的使用范圍和使用限量，然而市場上超范圍和超量使用食用合成色素的行為有擴展趨勢，如在禁止添加色素的肉制品、蝦制品、蟹制品中使用，在限制添加色素的豆制品、飲料、糖果、糕點、果凍中超量使用[1-4]。研究報告指出，合成色素的過量攝入會導(dǎo)致人體致瀉性、致突性與致癌作用[5-6]。目前國家對食用合成色素的用量作了嚴(yán)格規(guī)定[7]并制定了檢測方法[8-9]，國標(biāo)中[8-9]前處理采用聚酰胺吸附法。聚酰胺是具有酸堿二極性的化合物，在酸性條件下與水溶性酸性染料結(jié)合，而與天然色素、淀粉等物質(zhì)分離，然后在堿性條件下解吸食用合成色素。此純化過程步驟繁瑣、操作費時；對于含有大量蛋白質(zhì)、脂肪等固體樣品，按國標(biāo)方法用水提取時色素提取率低[4]，且在聚酰胺吸附色素后，經(jīng)G3垂融漏斗抽濾時容易出現(xiàn)堵塞現(xiàn)象[10]；另外，國標(biāo)方法采用254nm波長檢測，食品中許多化學(xué)物質(zhì)在此波長下有吸收，測定時易受樣品基質(zhì)的干擾[11]。QuEChERS作為一種新的前處理方法自2003年誕生以來，主要應(yīng)用在農(nóng)藥殘留檢測領(lǐng)域，具有快速、簡單、便宜、有效、可靠和安全的特點，其原理是利用吸附劑與基質(zhì)中的雜質(zhì)相互作用，吸附雜質(zhì)從而達到除雜凈化的目的。這一前處理技術(shù)目前在食品添加劑檢測領(lǐng)域應(yīng)用較少。本文針對國標(biāo)方法檢測食用合成色素存在的缺陷，首次采用QuEChERS方法[12]結(jié)合HPLC，研究肉制品、豆制品中食用合成色素的檢測方法，此方法具有更簡便的前處理過程、更高的效率，并能滿足分析的要求。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

檸檬黃、日落黃、莧菜紅、胭脂紅、誘惑紅、亮藍、偶氮玉紅 購于國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)中心（濃度為0.5mg/mL）；甲醇（色譜純） （Honeywell）公司；乙二胺-N-丙基硅烷（PSA）、十八烷基硅烷（ODS C18） Agela Technologies公司；其他試劑 均為分析純。

高效液相色譜儀（配有1525泵和2487紫外檢測器）、SunFireTMC18色譜柱（250mm×4.6mm，5μm） 美國Waters公司；KQ-100DE型數(shù)控超聲波清洗器 昆山市超聲儀器有限公司；高速離心機 Eppendorf公司；Milli-Q型超純水器 美國Millipore公司；WR-2001型溶劑過濾器 上海嘉鵬科技有限公司；UV-3010型紫外可見分光光度計 日本日立公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 樣品前處理

1.2.1.1 豆制品 將樣品攪碎，稱取5.0g樣品于50mL聚四氟乙烯離心管中，加入25mL無水乙醇-氨水-水（7∶2∶1），超聲10min，4000r/min離心10min。取上清液12mL置于另一50mL離心管中，加入吸附劑PSA100mg和C18300mg，渦旋2min，4000r/min離心15min，取10mL上清液置于蒸發(fā)皿中，用冰乙酸調(diào)節(jié)至中性，蒸至近干，用水定容至2mL，溶液經(jīng)0.22μm濾膜過濾后待用。

1.2.1.2 肉制品 將樣品攪碎，稱取5.0g置于50mL聚四氟乙烯離心管中，加入2g無水硫酸鈉，再加入10mL石油醚，充分振蕩1min，倒去石油醚，再用石油醚重復(fù)兩次以除盡油脂。揮干殘渣中的石油醚，然后加入25mL無水乙醇-氨水-水（7∶2∶1），超聲10min，4000r/min離心2min，以下步驟同豆制品。

1.2.2 色譜條件 色譜柱：SunFireTMC18（250mm×4.6mm，5μm）；流動相：甲醇-20mmol/L乙酸銨溶液，梯度洗脫程序（表1）；流速：1mL/min；柱溫：35℃；檢測波長：檸檬黃、亮藍410nm；日落黃、莧菜紅、胭脂紅、誘惑紅、偶氮玉紅520nm；進樣量：10μL。

表1 梯度洗脫程序Table 1 Program of gradient elution

1.2.3 提取和凈化條件的優(yōu)化 通過預(yù)實驗選取對食用合成色素回收率影響最大的4個因素做正交實驗，分別為：吸附劑的種類、含量、超聲時間、離心時間。設(shè)計正交實驗，以食用合成色素回收率為指標(biāo)，采用L9（34）正交表設(shè)計實驗，找出最佳提取凈化條件，因素水平如表2。

表2 正交實驗因素水平表Table 2 Factor and levels table of orthogonal test

1.2.4 方法學(xué)考察 在上述優(yōu)化后的最佳實驗條件下進行方法學(xué)驗證，包括線性關(guān)系、方法檢出限、最低定量限、加標(biāo)回收率、精密度。

回收率的計算公式：

式中：Z—回收率（%）；X—樣品中的殘留量（mg/kg）；M—空白樣品中色素測定值（mg/kg）；Y—樣品加標(biāo)量（mg/kg）。

精密度的計算公式：

CV（%）=（SD/X）×100 式（3）

式中：SD—標(biāo)準(zhǔn)偏差（%）；X—樣品中色素的平均值；N—測量次數(shù)；CV—相對標(biāo)準(zhǔn)偏差（%）。

2 結(jié)果與分析

2.1 提取和凈化條件的優(yōu)化

2.1.1 提取液的選擇 分別采用水、甲醇∶尿素（1∶1）和乙醇∶氨水∶水（7∶2∶1）對豆制品和肉制品中的食用合成色素進行提取，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用純水作提取劑時，樣品提取和凈化均不充分，各食用合成色素的加標(biāo)回收率僅為20%左右；用甲醇∶尿素（1∶1）作提取劑時，樣品提取液濃縮之后會有大量物質(zhì)析出難以凈化，影響色譜柱的使用壽命，且各食用合成色素的加標(biāo)回收率為50%～75%；用乙醇-氨水-水作提取劑時，豆制品和肉制品提取液經(jīng)過吸附劑凈化后，回收率高，凈化效果好。

2.1.2 凈化劑用量對回收率的影響 將一定量的食用合成色素標(biāo)準(zhǔn)溶液加入到乙醇∶氨水∶水（7∶2∶1）中，使?jié)舛冗_到0.5μg/mL，超聲10min后，取5mL混合溶液分別用100、200、300、400mg的PSA和100、200、300、400mg的C18吸附劑凈化，調(diào)節(jié)pH至中性，上機檢測。圖1A表明，隨著PSA用量的增加，對色素的吸附作用有遞增趨勢，當(dāng)吸附劑用量為400mg時，色素的回收率為88%左右；圖1B表明，C18對7種食用合成色素沒有吸附作用。

圖1 吸附劑對色素的吸附作用Fig.1 Recoveries of synthetic colorants after absorbed

2.1.3 提取條件和凈化劑用量的優(yōu)化 采用正交實驗對豆制品中7種食用合成色素的提取條件和凈化劑用量進行優(yōu)化。設(shè)計四因素三水平的正交實驗L9（34），以7種食用合成色素的平均回收率為考察指標(biāo)，結(jié)果見表3。

表3 正交實驗結(jié)果Table 3 Analysis of orthogonal test

由R值大小可知，影響食用合成色素回收率的因素順序為C（PSA）＞B（離心時間）＞A（超聲時間）＞D（C18）。選擇各因素最大k值的水平，確定出豆制品最佳的提取和凈化條件為A1B3C1D3，即超聲10min，離心15min，PSA為100mg，C18為300mg，此時平均回收率為96.98%。

肉制品由于油脂含量比較高，實驗發(fā)現(xiàn)，超聲提取5min后離心，當(dāng)離心時間超過3min，有油狀顆粒懸浮在提取液中，因此選擇4000r/min離心2min。

2.2 流動相的選擇

采用梯度洗脫，分別比較了甲醇-水、乙腈-10mmol/L乙酸銨以及甲醇-20mmol/L乙酸銨溶液作流動相對7種食用合成色素分離效果的影響，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，用甲醇-水作流動相時有某些物質(zhì)峰缺失，不能進行有效洗脫；用乙腈-10mmol/L乙酸銨作流動相時，可實現(xiàn)物質(zhì)的有效分離，但色譜峰存在拖尾現(xiàn)象；用甲醇-乙酸銨溶液作流動相時，獲得的色譜圖見圖2。從圖2可以看出，7種色素分離效果好，各物質(zhì)峰分離度均大于1.5，且峰型較好；其中亮藍由于是3種同分異構(gòu)體的混合物[13]，因而出現(xiàn)三個連續(xù)的峰，含量比為3∶21∶76。

圖2 7種食用合成色素色譜圖Fig.2 Chromatogram of seven synthetic colorants

2.3 方法學(xué)考察

2.3.1 線性關(guān)系和方法檢出限 取空白樣品提取液作為7種食用合成色素標(biāo)準(zhǔn)品的稀釋液，配制濃度為0.5、1、2、5、10μg/mL的色素工作液，以峰面積為縱坐標(biāo)，濃度為橫坐標(biāo)，計算回歸方程和相關(guān)系數(shù)。取空白雞肉樣品，做3個平行，按上述前處理方法提取、色譜條件進樣，得到空白樣品色譜圖，以信噪比S/N=3計算7種食用合成色素的檢出限LOD。從表4可知，除亮藍因是同分異構(gòu)體混合物，線性相關(guān)系數(shù)（0.9971）偏低和檢出限（0.3μg/mL）偏高外，其余6種食用合成色素的線性相關(guān)系數(shù)均達0.9999；檸檬黃、胭脂紅和日落黃的LOD為0.1μg/mL，莧菜紅、誘惑紅和偶氮玉紅的LOD為0.2μg/mL。

表4 7種食用合成色素的線性范圍、回歸方程、相關(guān)系數(shù)及檢出限Table 4 Linear ranges，regression equations，correlation coefficients and limit of detection of seven synthetic colorants

2.3.2 加標(biāo)回收率、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差及最低定量限（LOQ） 在5.0g空白雞肉中添加適量7種食用合成色素標(biāo)準(zhǔn)混合液，每個添加量3個平行，進行加標(biāo)回收率實驗，回收率、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差和LOQ見圖3和表5。結(jié)果表明，3份平行樣品中，7種食用合成色素的平均回收率均大于80%；相對標(biāo)準(zhǔn)偏差在4.53%～15.23%之間；以信噪比S/N=10計算7種食用合成色素的定量限LOQ，檸檬黃、莧菜紅、胭脂紅、日落黃和偶氮玉紅的LOQ為0.3mg/kg，誘惑紅和亮藍的LOQ為0.4mg/kg。

表5 7種食用色素的平均加標(biāo)回收率、相對標(biāo)準(zhǔn)偏差及LOQTable 5 Recovery、relative standard deviation and the limit of quantification of seven synthetic colorants

圖3 7種食用合成色素加標(biāo)色譜圖Fig.3 Chromatogram of seven synthetic colorants with the spiked sample

3 結(jié)論

建立了測定肉制品和豆制品中7種食用合成色素（檸檬黃、日落黃、胭脂紅、莧菜紅、亮藍、偶氮玉紅、誘惑紅）的QuEChERS-HPLC方法，樣品前處理簡單，處理一個樣品需要57min左右，而國標(biāo)方法則需要75min左右；并且QuEChERS方法還可批量處理樣品，節(jié)約人力，優(yōu)勢明顯；此外，采用可見區(qū)波長進行檢測，可減少樣品中基質(zhì)的干擾。因此，所建立的方法具有快速、簡便、適用于批量處理、實用性強等特點，為監(jiān)控食品中使用食用合成色素提供了一種快速、方便的方法。

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