劉叢叢，紀鳳娣，李 博，*

（1.中國農業(yè)大學食品科學與營養(yǎng)工程學院，北京10083；2.北京一輕研究院，北京100083）

我國發(fā)酵蔬菜歷史悠久，其起源最早可追溯到距今3100多年前的周朝，《周禮·天官》記載：“大羹不致五味，鉶羹加鹽菜矣”。四川的榨菜、泡菜，浙江的蘿卜干、腌雪里蕻，揚州醬菜、玫瑰大頭菜和東北的酸菜等都別具風味，深受廣大群眾的喜愛，不但暢銷于國內，而且還遠銷數十個國家和地區(qū)。但是目前我國蔬菜發(fā)酵領域存在的高鹽、微生物超標及亞硝酸鹽安全性等問題[1-2]，使人們對其消費產生顧慮，并直接影響其出口。1943年Wilson指出蔬菜中的硝酸鹽可被還原為亞硝酸鹽。亞硝酸鹽可與機體內的胺類物質在一定條件下合成N-亞硝基化合物，簡稱亞硝胺。自1956年亞硝胺被證明是強致癌物以來，食品中亞硝酸鹽和亞硝胺的含量及其致癌性就引起了眾多食品工藝學家和營養(yǎng)衛(wèi)生學家的關注[3-5]。近年來，國內對醬腌菜腌制過程中亞硝酸鹽產生的原因，含量及消除措施等方面做了一些研究。蔬菜自然發(fā)酵過程中會形成亞硝峰[6-8]，并且微生物硝酸鹽還原酶對亞硝峰的形成起決定作用[9-10]，而亞硝酸鹽的降解則是多方面作用的結果，微生物的亞硝酸鹽還原酶在亞硝峰形成前期起主要作用，有機酸則在發(fā)酵后期對亞硝酸鹽的降解起主要作用[11]。這些研究對通過改進發(fā)酵工藝從而實現對亞硝酸鹽的控制有積極的指導作用。本文擬通過接種乳酸菌發(fā)酵和調酸發(fā)酵工藝來解決發(fā)酵白菜中亞硝酸鹽的食品安全問題，以期更好地適應中國發(fā)酵蔬菜“天然化、療效化、低鹽化以及多樣化、方便化”的時代發(fā)展要求。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

白菜 購自中國農業(yè)大學菜市場，新鮮未經儲藏；精制食用鹽 北京市鹽業(yè)公司；植物乳桿菌（Lactobacillus plantarum Jlab） 本實驗室在白菜發(fā)酵過程中分離所得；硝酸鈉、亞硝酸鈉、十六烷基三甲基溴化銨 均購自Sigma（USA）；MRS、結晶紫中性紅膽鹽瓊脂、營養(yǎng)瓊脂 皆為生化試劑，分別購自Sigma（USA）、Flucka（USA）和北京奧博星；其他所用試劑 均為分析純。

MLS-3020全自動殺菌釜、MCO-20AIC二氧化碳培養(yǎng)箱 日本三洋電器有限公司；FLC-3超凈工作臺 哈爾濱市東聯電子技術開發(fā)有限公司；LRH-250生化培養(yǎng)箱 上海一恒科技有限公司；pHS-25酸度計 上海雷磁；SHIMADZU LC-10A高效液相色譜 日本島津；Cintra6GBC紫外可見分光光度計 澳大利亞；HZS-H冷凍離心機 哈爾濱市東聯電子技術開發(fā)有限公司。

1.2 實驗方法

1.2.1 發(fā)酵白菜的制作 自然發(fā)酵白菜的制作：將新鮮購得的白菜去掉外層菜幫和根等不可食用的部分，并棄去有病蟲害的葉子，去掉菜心，洗凈，切成約2cm×3cm的大小一致的小塊。處理后的白菜與8%（w/v）的鹽水按照質量體積比為1∶1的比例混勻后，鹽漬8h，將菜取出，瀝干水分。在800mL的玻璃瓶中（玻璃瓶洗凈用鋁箔密封后，在121℃，15min高壓滅菌，烘干，共12瓶）加入蔬菜200g，然后加入6%（w/v）的鹽水400mL，混勻，用鋁箔將玻璃瓶密封，置于18℃恒溫下發(fā)酵7d。每天取發(fā)酵白菜樣品和發(fā)酵液，每次取3個平行樣。

接種發(fā)酵白菜的制作：與自然發(fā)酵相同，稱取預腌8h、瀝干的白菜200g置于玻璃瓶中。30℃活化18～20h后的植物乳桿菌經4℃10000g 5min離心得菌體，接入400mL 6%（w/v）的鹽水中，使其初始濃度為2×106CFU/mL。將含菌鹽水倒入玻璃瓶中，與白菜塊混勻，其他發(fā)酵條件與自然發(fā)酵相同。

調酸發(fā)酵白菜的制作：與自然發(fā)酵相同，用0.2mol/L乳酸-乳酸鈉緩沖液調節(jié)鹽水，使其pH分別為5.0、4.5、4.0、3.5，其他發(fā)酵條件與自然發(fā)酵相同，發(fā)酵時間為5d。

1.2.2 樣品制備 發(fā)酵后的白菜取樣量為100g，發(fā)酵液樣品無菌操作取樣40mL，按照國標GB/T 5009.33-2010的方法進行預處理。

1.2.3 pH的測定 無菌取40mL發(fā)酵液，用pH計測定其pH。

1.2.4 微生物檢測 微生物檢測采用平板計數法。無菌取樣200g進行無菌均質（12000r/min）2min，過濾，用無菌生理鹽水（0.85%，w/v）進行梯度稀釋，取兩個合適的稀釋度，傾注平板，計數?？偤醚蹙═MAB）的檢測在營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基上，37℃下恒溫培養(yǎng)24～28h后進行計數。乳酸菌（LAB）的檢測在添加了0.2%的那他霉素（Delft，the Netherlands）的MRS培養(yǎng)基上，30℃下恒溫培養(yǎng)48～72h后進行計數。腸道菌群（Enterobacteria）的檢測在結晶紫中性紅膽鹽瓊脂培養(yǎng)基上，30℃下恒溫培養(yǎng)24～36h后進行計數。

1.2.5 硝酸鹽的測定 發(fā)酵白菜和發(fā)酵液中硝酸鹽含量的測定采用基于Ito等[12]的高效液相色譜法。進樣前，樣品先用0.22μm的微孔濾膜過濾。所用涂敷溶液為：含1mmol/L溴化十六烷基三甲銨（CTAB）體積比為20：80的甲醇-水溶液。流動相：pH6.2的磷酸胺（5mmol/L）-NaCl（0.1mol/L）緩沖液，流速1mL/min，進樣10μL，檢測波長210nm。涂敷柱溫與分析樣品時的柱溫均設定為25℃。

1.2.6 亞硝酸鹽的測定 發(fā)酵白菜和發(fā)酵液中亞硝酸鹽含量的測定按照GB/T 5009.33-2010中的方法進行。其中，亞硝酸鹽的標準曲線按照下述過程測定。準確稱取0.1000g經硅膠干燥器干燥24h的亞硝酸鈉，加去離子水溶解，移入500mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，混勻。吸取該溶液5.00mL，置于200mL容量瓶中，加水稀釋至刻度，此溶液即為亞硝酸鈉標準使用液。吸取0.00、2.00、3.00、4.00、5.00、6.00、7.00、8.00mL亞硝酸鈉標準使用液，分別置于50mL具塞比色管中，加入2mL對氨基苯磺酸溶液（4g/L），混勻，靜置3min后各加入1mL鹽酸萘乙二胺溶液（2g/L），加水至刻度，混勻，靜置15min，用2cm比色杯，以添加量為零的比色管調節(jié)零點，測定其在538nm處的吸光值，并繪制標準曲線。

1.2.7 統(tǒng)計分析 以上實驗均重復三次，每次3個平行，所用數據皆為平均值。采用SPSS（SPSS 11.0）統(tǒng)計軟件對數據進行分析，并進行單因素方差分析（ANOVA）與多重比較分析（Multiple Comparisons），顯著性水平為p＜0.05。

2 結果與分析

2.1 接種發(fā)酵工藝對發(fā)酵白菜的影響

2.1.1 接種發(fā)酵對發(fā)酵液pH及微生物的影響 由表1可知，經自然發(fā)酵與接種發(fā)酵處理的白菜發(fā)酵液其pH一直呈現下降的趨勢，自然發(fā)酵處理5d后發(fā)酵液的pH降至4.0以下，而接種發(fā)酵處理3d后發(fā)酵液的pH就已降至4.0以下，pH下降的速度顯著高于前者。趙大云等[13-14]采用接種Bacillus coagulans低鹽腌漬雪里蕻時，腌菜的產酸速度也明顯加快。這表明，在達到相同酸度時，采用接種發(fā)酵可以減少發(fā)酵時間，從而更適合快速即食式的產品生產。

表1 發(fā)酵過程中pH的變化Table 1 Changes of pH during the fermentation

在自然發(fā)酵與接種發(fā)酵過程中，白菜中微生物的變化見圖1～圖3。在接種發(fā)酵過程中，當發(fā)酵1d時，發(fā)酵液中乳酸菌的數量就達到了107CFU/mL（見圖1）。在第2～4d時，基本保持在108CFU/mL。而在自然發(fā)酵過程中，發(fā)酵3d后發(fā)酵液中的乳酸菌的數量才達到107CFU/mL。總好氧菌與腸道菌群在自然發(fā)酵第2、3d后，一直保持在較高數量級上，達到108CFU/mL（見圖2和圖3）。而在接種發(fā)酵的處理下，總好氧菌與腸道菌群在發(fā)酵過程中的數量一直保持在較低的水平，其最高值約為106CFU/mL，顯著低于自然發(fā)酵過程中的含量（p＜0.05）。結合發(fā)酵液pH的變化可知，接種發(fā)酵時，白菜中的乳酸菌含量迅速增加，同時發(fā)酵液的pH快速下降，從而使總好氧菌（TMAB）和腸道菌群的生長受到抑制，使產品更安全。

圖1 發(fā)酵過程中乳酸菌的變化圖Fig.1 LAB changes during the fermentation

圖2 發(fā)酵過程中TMAB的變化Fig.2 TMAB changes during the fermentation

圖3 發(fā)酵過程中腸道菌的變化Fig.3 Enterobacteria changes during the fermentation

2.1.2 接種發(fā)酵對白菜中硝酸鹽含量的影響 由表2可知，未發(fā)酵的白菜中硝酸鹽的含量很高，而發(fā)酵初始時發(fā)酵液中幾乎沒有硝酸鹽。不管是在自然發(fā)酵還是接種發(fā)酵過程中，白菜組織中硝酸鹽的含量都呈現下降的趨勢，而發(fā)酵液中的硝酸鹽含量都呈現上升趨勢。這個結果與國內大多數人的結果相似[15-16]。這說明，白菜組織中的硝酸鹽隨著發(fā)酵的進行，有一部分進入了發(fā)酵液中，發(fā)酵可以降低白菜組織中的硝酸鹽含量。雖然，自然發(fā)酵與接種發(fā)酵過程中，最初的硝酸鹽總體含量不同，并且有顯著差異（p＜0.05），但發(fā)酵至第7d時，自然發(fā)酵液中硝酸鹽的含量上升了8倍左右，而采用接種發(fā)酵的處理方式時，其含量上升了約12.8倍，顯著高于自然發(fā)酵液中硝酸鹽的含量（p＜0.05），這表明，接種發(fā)酵更有利于白菜組織中的硝酸鹽轉移至發(fā)酵液中。

表2 接種發(fā)酵對白菜和發(fā)酵液中硝酸鹽含量的影響Table 2 Effect of inoculating fermentation on nitrate content in cabbages and brine

2.1.3 接種發(fā)酵對白菜中亞硝酸鹽含量的影響 由表3可知，不管是發(fā)酵液還是白菜中，樣品中的亞硝酸鹽含量都是先逐漸升高再降低，在第3d時亞硝酸鹽含量達到最高值，到第7d時亞硝酸鹽的含量降至很低的水平。而紀淑娟等[17]人的研究結果顯示，室溫20℃條件下，大白菜在自然發(fā)酵過程中亞硝酸鹽峰值出現在第6d。蒲朝文等[15]的研究則表明，當鹽濃度為6%時，腌制7d的醬腌菜中亞硝酸鹽含量最高。這些結果的差異可能與發(fā)酵條件有關，吳正奇等[18]指出，亞硝酸鹽峰值出現時間會受到溫度、鹽濃度、酸度、有害微生物的污染及含糖量的影響。自然發(fā)酵時，白菜組的亞硝酸鹽含量最高可達32.6mg/kg，發(fā)酵液中亞硝酸鹽含量最高為28.9mg/kg，皆高于國家安全標準（20mg/kg）。但是，采用接種發(fā)酵的處理，則在整個發(fā)酵過程中，白菜和發(fā)酵液的亞硝酸鹽含量一直處于較低的水平，其平均值都不超過1mg/kg。這可能是由于發(fā)酵初期存在較多的乳酸菌，一方面使得亞硝酸鹽大量的被酶降解掉，另一方面，抑制了能夠使硝酸鹽還原的細菌如大腸桿菌等的生長，從而使亞硝酸鹽含量降低。因此，采用接種發(fā)酵工藝可以有效的減少發(fā)酵白菜中的亞硝酸鹽。

表3 接種發(fā)酵對白菜和發(fā)酵液中亞硝酸鹽含量的影響Table 3 Effect of inoculating fermentation on nitrite content in cabbages and brine

2.2 調酸發(fā)酵工藝對發(fā)酵白菜的影響

2.2.1 調酸發(fā)酵對白菜中硝酸鹽含量的影響 調酸發(fā)酵過程中發(fā)酵液和白菜組織中硝酸鹽含量的變化見圖4和圖5。由圖4～圖5可知，發(fā)酵液的起始pH與白菜中硝酸鹽的降低有直接的影響，起始pH越低，白菜中硝酸鹽的降低速度越快，而發(fā)酵液中硝酸鹽的含量增加的也越快。發(fā)酵結束后，發(fā)酵白菜中硝酸鹽的濃度與發(fā)酵液中硝酸鹽的濃度趨于一致，約為360mg/kg，顯著低于白菜樣品的初始硝酸鹽含量。因而，控制初始發(fā)酵液的pH能夠調控樣品中硝酸鹽向發(fā)酵液中的滲透，pH越小，滲透速度越快。

圖4 調酸發(fā)酵過程中白菜中硝酸鹽的變化Fig.4 Changes of nitrate in cabbages during the adjusting acid fermentation

圖5 調酸發(fā)酵過程中發(fā)酵液硝酸鹽的變化Fig.5 Changes of nitrate in brine during the adjusting acid fermentation

2.2.2 調酸發(fā)酵對白菜中亞硝酸鹽含量的影響 調酸發(fā)酵過程中發(fā)酵液pH的變化見圖6。在自然處理（pH為6.5）與酸調初始pH為5.0、4.5的處理下，發(fā)酵液pH隨著發(fā)酵的進行而逐漸降低。而酸調初始pH為4.0、3.5時，在5d的發(fā)酵時間內，發(fā)酵液的pH比較穩(wěn)定，并沒有顯著變化（p＞0.05）。

圖6 調酸發(fā)酵過程中pH的變化Fig.6 Changes of pH during the adjusting acid fermentation

由表4、表5可知，自然發(fā)酵中不管是發(fā)酵液中還是發(fā)酵白菜中亞硝酸鹽都會出現一個比較高的峰值，峰值出現時，此時發(fā)酵液的pH約為4.5（見圖6）。調制初始pH為5.0的處理時，峰值亞硝酸鹽的含量顯著低于自然發(fā)酵未調酸的對照（p＜0.05）。而當調制液的初始pH低于4.5時，發(fā)酵過程中不會形成亞硝酸鹽的峰值，亞硝酸鹽的含量＜3mg/kg，顯著低于自然對照與調制為初始pH為5.0的處理（p＜0.05）。這一結果與張少穎的研究相似[4]，其研究表明，降低發(fā)酵液初始pH可以抑制泡菜發(fā)酵過程中的硝酸還原酶活性，從而降低樣品中亞硝酸鹽的含量。因此，酸調初始發(fā)酵液的pH＜4.5時，可以減少發(fā)酵白菜中的亞硝鹽含量，使其符合國家安全標準。

表4 發(fā)酵過程中發(fā)酵液中亞硝酸鹽的變化（mg/L）Table 4 Changes of nitrite in brine during the fermentation（mg/L）

表5 發(fā)酵過程中白菜中亞硝酸鹽的變化（mg/L）Table 5 Changes of nitrite in Chinese cabbages during the fermentation（mg/L）

3 結論

當接種初始濃度為2×106CFU/mL的乳酸菌進行發(fā)酵時，白菜中亞硝酸鹽含量平均值不超過1mg/kg，沒有明顯的峰值形成，并且白菜中硝酸鹽的含量也顯著低于自然發(fā)酵的處理。對初始發(fā)酵液進行酸調，能夠對發(fā)酵過程中亞硝酸鹽的形成產生影響，將初始發(fā)酵液的pH調至低于4.5時，可以抑制發(fā)酵過程中亞硝酸鹽的產生，使其低于3mg/kg。從降低亞硝酸鹽的角度考慮，接種與調酸發(fā)酵工藝都能使發(fā)酵白菜中亞硝酸鹽含量低于國家安全標準，比自然發(fā)酵工藝對人體健康更為有利。

[1]楊惠芬，黃流生，謝斌，等.食品中亞硝酸鹽允許限量的研究[J].衛(wèi)生研究，1995，24（3）：176-178.

[2]岳虹.腌制菜亞硝酸鹽含量的調查分析[J].太原師范學院學報，2011，10（3）：140-143.

[3]馬儷珍，南慶賢，方長法.N-亞硝胺類化合物與食品安全性[J].農產品加工·學刊，2005（12）：8-14.

[4]張少穎.不同處理方法對泡菜發(fā)酵過程中亞硝酸鹽含量的影響[J].中國食品學報，2011，11（1）：133-138.

[5]石振興，胡永金，朱仁俊.腌制蔬菜的品質及亞硝酸鹽問題研究進展[J].中國調味品，2009，34（5）：25-28.

[6]劉玉龍.大白菜腌制過程中亞硝酸鹽形成規(guī)律的研究[D].沈陽：沈陽農業(yè)大學，1985.

[7]李基銀.腌菜質量與衛(wèi)生[M].北京：輕工業(yè)出版社，1998，16-18.

[8]潘楓.北方酸菜中亞硝酸鹽生成規(guī)律的研究[J].中國釀造，1988，（6）：28-31.

[9]燕平梅，薛文通，張慧，等.不同貯藏蔬菜中亞硝酸鹽變化的研究[J].食品科學，2006，27（6）：242-246.

[10]紀淑娟，孟憲軍.大白菜發(fā)酵過程中亞硝酸鹽消長規(guī)律的研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，2001，27（2）：42-46.

[11]張慶芳.蔬菜腌漬發(fā)酵亞硝酸鹽降解機理和提高白菜品質方法的研究[D].沈陽：沈陽農業(yè)大學，2001.

[12]Ito K，Ariyoshi Y，Tanabiki F，et al.Anion chromatography using octadecylsilane reversed-phase columns coated with cetyltrimethylammonium and its application to nitrite and nitrate in seawater[J].Analytical Chemistry，1991，6（3）：273-276.

[13]趙大云，丁霄霖.接種Bacillus coagulans低鹽腌漬雪里蕻的探討（Ⅰ）[J].中國釀造，2000（6）：9-12.

[14]趙大云，丁霄霖.接種Bacillus coagulans低鹽腌漬雪里蕻的探討（II）[J].中國釀造，2001（1）：16-20.

[15]郭曉紅，楊潔彬，張建軍.甘蘭乳酸發(fā)酵過程中亞硝峰消長機制及抑制途徑的研究[J].食品與發(fā)酵工業(yè)，1989（2）：26-34.

[16]何淑玲，李博，籍保平.泡菜發(fā)酵過程中硝酸鹽還原酶活性的研究[J].食品科技，2005（1）：94-97.

[17]蒲朝文，夏傳福，謝朝懷，等.醬腌菜腌制過程中亞硝酸鹽含量動態(tài)變化及消除措施的研究 [J].衛(wèi)生研究，2001，30（6）：352-354.

[18]吳正奇，凌秀菊.醬腌菜生產過程中亞硝酸鹽和亞硝胺的產生與預防[J].中國調味品，1996（8）：8-12.